發(fā)布時間：2020-08-01 10:32

【摘要】：雄激素受體(Androgen receptor,AR)是I型核受體家族成員,在男性性特征發(fā)育及表型維持中發(fā)揮著重要的作用。在雄激素的不存在的情況下,雄激素受體處于非激活狀態(tài)與熱啟動蛋白相互作用定位于細胞質(zhì)中,在雄激素的作用下,雄激素受體發(fā)生構(gòu)象改變,形成二聚體進而轉(zhuǎn)入細胞核中,激活靶基因的表達,誘導(dǎo)細胞增殖,分化等生理活動,這樣的通路被認為是雄激素受體經(jīng)典通路,也稱為基因組雄激素受體通路。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)雄激素受體可以在幾分鐘內(nèi)快速的應(yīng)答雄激素受體,而這種快速的應(yīng)答不依賴于雄激素受體的細胞核轉(zhuǎn)移,不依賴于靶基因的表達,因而把這樣一種雄激素受體通路稱為非基因組雄激素受體通路。通過非基因組雄激素受體通路,雄激素受體可以激活PI3K-AKT,ERK,Src等信號傳導(dǎo)通路等。近來隨著對雄激素受體非基因組功能研究的深入,科研人員發(fā)現(xiàn)AR除了發(fā)生細胞核轉(zhuǎn)移,同時AR也可在雄激素的作用下發(fā)生快速的細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移,而這種AR的細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移與PI3K-AKT的激活相關(guān),干擾AR的細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移,抑制AKT的磷酸化與激活,暗示AR的細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移可能對AR的功能有著重要意義。有研究認為AR的細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移與caveolin-1蛋白相關(guān),過表達caveolin-1可檢測到更多的AR轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)膜,但多數(shù)前列腺癌細胞系中,AR與caveolin-1并不存在共表達,暗示表達caveolin-1可能參與協(xié)助AR的細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移,但該轉(zhuǎn)移并不依賴于caveolin-1。目前對于AR具體是通過何種方式轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)膜并不是很清楚。相反AR的細胞核轉(zhuǎn)運的機制研究較為明確,AR與動力蛋白dynein結(jié)合通過微管依賴的模式轉(zhuǎn)移至近核端,隨后依賴于Importinα/β介導(dǎo)的通路完成入核過程。那么AR的細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移過程又是如何呢,是否也依賴于微管呢?是否也需要馬達蛋白相互作用進而通過微管轉(zhuǎn)運呢?同時AR轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)膜后,除了激活PI3K-AKT通路還參加哪些細胞生理過程呢?針對以上未知問題,本論文首先通過免疫熒光和細胞質(zhì)膜組分分離手段,證明了在雄激素的作用下,AR可以發(fā)生快速的細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移,通過雄激素受體拮抗劑可有效的抑制AR的細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移,進一步說明中AR的細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移由雄激素誘導(dǎo)。通過蔗糖密度梯度離心的方式,我們對AR的細胞質(zhì)膜定位進行了定量分析,發(fā)現(xiàn)雄激素作用20分鐘的條件下,8%左右的AR轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)膜,充分證明了在雄激素作用下AR可發(fā)生快速的細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移。進一步,本論文發(fā)現(xiàn)使用微管靶向藥物多西紫杉醇(抑制微管解聚)或諾考達唑(抑制微管穩(wěn)定)均可抑制AR的細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移,而通過細胞松弛素D干擾微絲的功能對AR的細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移沒有作用,證明了AR的細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移依賴于微管但并不依賴于微絲。進一步探究本論文發(fā)現(xiàn)KIF5B作為驅(qū)動蛋白介導(dǎo)了AR依賴于微管的運輸,通過dominant-negative mutant或者siRNA敲除KIF5B,均抑制了AR的細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移。同時干擾KIF5B的功能也抑制了下游AKT的激活,證明了KIF5B參與AR的細胞質(zhì)膜運輸。如果KIF5B是以驅(qū)動蛋白的形式參與AR運輸,那么AR與KIF5B之間一定存在相互作用,通過免疫沉淀實驗,發(fā)現(xiàn)AR與KIF5B存在相互作用,同時雄激素可以誘導(dǎo)AR與KIF5B之間作用加強。通過構(gòu)建不同AR功能結(jié)構(gòu)域的缺失,進一步發(fā)現(xiàn)AR是通過N端結(jié)構(gòu)域參與與KIF5B的相互作用,基于以上實驗,充分說明了驅(qū)動蛋白KIF5B介導(dǎo)了AR的細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移。棕櫚�；揎棇τ诘鞍踪|(zhì)的細胞質(zhì)膜定位有重要意義,固醇類核受體家族成員均可發(fā)生棕櫚酰化修飾,AR的棕櫚�；揎棸l(fā)生在第807位半胱氨酸,通過使用2-bromopalmitate特異性抑制AR的棕櫚酰化修飾或者突變其棕櫚�；稽c(AR-C807A)可有效的抑制AR的細胞質(zhì)膜定位,但不能影響AR與KIF5B的結(jié)合,暗示棕櫚�；揎椏赡軈⒓覣R的細胞質(zhì)膜錨定,但并不參與AR向細胞質(zhì)膜運輸?shù)倪^程。進一步對細胞質(zhì)膜定位的AR的進行功能研究,發(fā)現(xiàn)干擾AR細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移抑制了AR對靶基因的調(diào)控,減弱了雄激素作用下AR對PSA和TMRPSS2的mRNA的誘導(dǎo)作用,通過免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)AR-C807A(細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移缺失AR)不僅不能定位于細胞質(zhì)膜,在雄激素作用下其細胞核轉(zhuǎn)移速率也受到了抑制,應(yīng)用細胞核質(zhì)蛋白分離手段,進一步確認了在雄激素作用下AR-C807A具有較慢的入核速率。以上實驗說明了8%發(fā)生細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移的AR可以調(diào)控其余AR的入核過程,調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性,調(diào)節(jié)其基因組功能。野生型的AR在雄激素的作用下可以快速誘導(dǎo)HSP27的磷酸化,磷酸化的HSP27隨后可與AR結(jié)合,協(xié)助AR的快速入核,本論文發(fā)現(xiàn)AR-C807A在雄激素的作用下不能誘導(dǎo)HSP27的磷酸化,暗示細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移AR可能通過磷酸化HSP27,進而調(diào)節(jié)AR的細胞核轉(zhuǎn)移。進一步確認HSP27的作用,本論文在將HSP27-mimic(磷酸化HSP27)和AR-C807A共表達,發(fā)現(xiàn)HSP27-mimic可以恢復(fù)AR靶基因TMRPSS2的表達,同時可以恢復(fù)部分由AR-C807A抑制的細胞增殖,充分證明了細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移AR通過激活HSP27調(diào)節(jié)AR的基因組功能,調(diào)節(jié)細胞增殖,靶基因的表達�？偨Y(jié)以上實驗,本論文對AR細胞質(zhì)膜機制及其作用進行了深入研究,發(fā)現(xiàn)了AR通過微管依賴的方式發(fā)生細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移,驅(qū)動蛋白KIF5B通過與ARN端結(jié)構(gòu)域結(jié)合介導(dǎo)了這一轉(zhuǎn)運過程,發(fā)生細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移的AR可以調(diào)節(jié)AKT的激活,磷酸化HSP27,進而調(diào)控AR的細胞核轉(zhuǎn)移及其轉(zhuǎn)錄活性。以上研究為完善雄激素信號傳統(tǒng)通路提供了重要的實驗數(shù)據(jù)。同時AR的細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移可以發(fā)生在極低的雄激素濃度下(去勢抵抗治療條件下)也暗示AR的細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移可能在去勢抵抗前列腺癌中發(fā)揮著重要作用,為去勢抵抗前列腺癌的治療也提供了新的分子機制。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.25
【圖文】：

受體（mineralocorticoid receptor，MR）22 24。雄激素受體主要表達應(yīng)答雄激素的組織中，比如前列腺，骨骼肌，肝臟和中央神經(jīng)系統(tǒng)25。雄激素受體可以被內(nèi) 源 的 雄 激 素 激 活 ， 包 括 睪 酮 （ Testosterone ） 和 5α- 雙 氫 睪 酮 （ 5α-hihydrotestosterone，DHT）。雄激素受體參與眾多生理過程，包括促進青春期發(fā)育，參與前列腺發(fā)育與功能26 28。1.2.1 雄激素受體結(jié)構(gòu)雄激素受體基因由 X 染色體長臂 q11-12 編碼，其 mRNA 約為 10.6kb，包括 8個不同的外顯子29 31。雄激素受體蛋白由 920個氨基酸組成，分子量為 110KDa，分成 4 個不同的功能結(jié)構(gòu)域，包括 N 端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，NTD ）， DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ DNA binding domain ，DBD），Hinge 結(jié)構(gòu)域（Hinge domain）以及 C 端配體結(jié)構(gòu)域（Ligand binding domain，LBD）22,28。每個結(jié)構(gòu)域?qū)τ谛奂に厥荏w的功能完整性都具有重要意義。

圖 1.2 雄激素受體可變剪切Figure 1.2 Androgen receptor splice variantsEndocr. Relat. Cancer.; 23 （2016）在這 20 多種 ARVs 中，ARV7 的表達率最高，有文獻對去勢抵抗前列腺癌患者的血樣中循環(huán)腫瘤細胞的 DNA 進行提取，發(fā)現(xiàn)在大于 50%的樣本中檢測到 ARV786。ARV7 的 mRNA 包括 AR 經(jīng)典的前三個外顯子，和一個 V7 特異性的外顯子 CE3，CE3 表達一個 16 氨基酸的序列，該序列為 ARV7 特有的，CE3的剪切造成外顯子 4-8 無法正確剪切，因而 ARV7 缺失 C 端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。ARV7 因缺少 C 端配體結(jié)構(gòu)域，并不能與雄激素結(jié)合，同時因其具有部分入核序列，而缺少出核序列，ARV7 無論在配體存在下或者配體缺失情況下均定位于細胞核中，同時具有持續(xù)活性。ARV7 的表達與紫杉醇類藥物抵抗相關(guān)，紫杉醇類藥物可干擾微管的結(jié)合，進而干擾 AR 的細胞核轉(zhuǎn)移過程，而研究發(fā)現(xiàn)

圖 1.3 經(jīng)典雄激素受體傳導(dǎo)通路Figure 1.3 Classical androgen receptor signaling pathwayNature Reviews Cancer, 1, 34-45, （2001）激素受體功能相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的雄激素受體通路中，AR 的功能及活性可通過與不同的被調(diào)控。在激活狀態(tài)下即 AR 與激動劑結(jié)合狀態(tài)下，A加其轉(zhuǎn)錄活性，包括甾類激素受體共調(diào)節(jié)因子（steroidSRC）, CREB 結(jié)合蛋白（CREB binding proteins ，CBP結(jié)合因子（p/CAF）等，進而協(xié)助高效轉(zhuǎn)錄105。表 1.4 為ctivator 及其功能。在抑制狀態(tài)下，即 AR 與拮抗劑結(jié)合狀repressor，包括 SMRT (silencing mediators of retinoic acid

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