【摘要】：背景及目的:小細胞肺癌約占全體肺癌的20%,是惡性程度最高,預后最差的惡性腫瘤之一,五年生存率低于5%。小細胞肺癌無明確的靶向驅動基因,易復發(fā),預后差。細胞周期檢測點激酶1(Chk1)會使化療藥物作用下DNA損傷的腫瘤細胞周期停滯,并促進DNA同源重組及損傷修復,被認為是化療耐藥的主要原因之一。Chk1抑制劑消除S期內檢測點監(jiān)測,可以造成復制災難促進細胞凋亡;抑制消除DNA毒性藥物造成細胞周期阻滯,促使細胞攜帶受損DNA進入有絲分裂期,造成有絲分裂災難促使細胞死亡,Chk1抑制劑在某些實體腫瘤的臨床實驗中也表現(xiàn)出一定的對腫瘤的抑制作用,但Chk1抑制劑對小細胞肺癌的作用效果仍不清楚,作用機制仍不明確。是否與順鉑有協(xié)同作用,對順鉑耐藥的小細胞肺癌是否有逆轉效果同樣需要研究,我們希望在臨床病例分析、細胞分子水平及動物模型三方面探討Chk1抑制劑對小細胞肺癌的抑瘤作用和促凋亡機制。同時,限制Chk1抑制劑的臨床應用主要由于藥物的毒副作用、耐受性和藥物的繼發(fā)性耐藥,我們希望通過構建Chk1抑制劑繼發(fā)性耐藥小細胞肺癌細胞系,研究繼發(fā)性耐藥中的細胞特性和耐藥水平的調控機制,篩選耐藥熱點蛋白和可能性致耐藥的信號通路,為小細胞肺癌的治療提供潛在的新靶點,并深入了解耐藥調控機制為耐藥逆轉提供新的思路和策略。方法:應用細胞周期檢測點激酶1抑制劑prexasertib(LY2606368)及聯(lián)合順鉑對不同P53及Rb基因狀態(tài)的小細胞肺癌細胞系的抑瘤效果進行研究,應用CellTitle Glo檢測細胞存活率,同時通過流式細胞術、蛋白印跡法對小細胞肺癌細胞內各細胞周期影響及Caspase依賴性細胞凋亡通路的蛋白變化進行研究,同時以siRNA調減,慢病毒轉染調高關鍵蛋白驗證,通過siRNA調減、質粒轉染調高E2F1表達,qRT-PCR及蛋白印跡驗證E2F1在Chk1抑制劑抑瘤作用中所起作用。建立順鉑繼發(fā)耐藥細胞系,了解通過裸鼠異種腫瘤原位種植技術驗證細胞周期檢測點激酶1及其聯(lián)合順鉑時對小細胞肺癌細胞系及順鉑耐藥細胞系的抑瘤作用。建立Chk1抑制劑繼發(fā)性耐藥小細胞肺癌細胞系,應用反向蛋白序列分析(RPPA)對比親代系篩選熱點靶向蛋白,對建立的Chk1抑制劑繼發(fā)性耐藥的小細胞肺癌細胞系通過siRNA調減,電轉染親代系調高相應RPPA篩選的熱點蛋白,應用CellTitleGlo,蛋白印跡,qRT-PCR觀察對Chk1抑制劑耐藥能力的變化及相關凋亡蛋白和細胞周期調控蛋白的變化情況,對繼發(fā)性耐藥細胞系進行單細胞克隆培養(yǎng),應用用CellTitleGlo,蛋白印跡,qRT-PCR應用對單克隆觀察Wee1基因拷貝數變化,mRNA水平,蛋白水平表達與耐藥水平的相關性。通過免疫組化,組織芯片對手術切除小細胞肺癌Wee1、Chk1表達水平及與預后相關性分析。結果:Chk1抑制劑可以在不同p53基因狀態(tài)的小細胞肺癌細胞系中觀察到明顯的抑瘤效果,同時和順鉑有明顯的協(xié)同效應。Chk1抑制劑可以消除順鉑處理后造成的G1/S及G2/M期細胞周期阻滯,細胞凋亡明顯增加,DNA損傷標志物γH2AX,DNA損傷修復標志物Cleaved PARP明顯增加,細胞周期進入有絲分裂期的標志物pHH3均明顯增高。Western Blot顯示單獨應用Chk1抑制劑或siChk1處理或聯(lián)合應用順鉑后對小細胞肺癌細胞系的協(xié)同抑瘤作用,這種抑瘤作用主要通過激活Caspase為主導的細胞凋亡通路并下調E2F1表達形成的。動物實驗驗證Chk1抑制劑對小細胞肺癌有抑瘤作用,同順鉑有協(xié)同作用,并能逆轉順鉑耐藥,Wee1的表達水平與Chk1繼發(fā)性耐藥水平顯著相關,siRNA調減Wee1或應用Wee1抑制劑可以逆轉耐藥,消除G2/M期阻滯,增加細胞凋亡。親代系質粒轉染后可以獲得耐藥能力,同時對Wee1調控的下游蛋白和激酶CDK1及CDC25C應用相應的siRNA調減后均會使親代系獲得耐藥能力。單細胞克隆實驗提示Wee1 DNA拷貝數、mRNA相對水平及蛋白表達水平與繼發(fā)耐藥水平呈顯著正相關。RPPA篩選出耐藥系中表達調高的蛋白主要集中在細胞凋亡和增殖,細胞周期調控相關蛋白上,其中p38MAPK在應用藥物處理后其磷酸化蛋白增高7倍以上,siRNA或小分子抑制劑調低p38MAPK表達可以逆轉Chk1抑制劑繼發(fā)性耐藥小細胞肺癌細胞系的耐藥性。TMA結果提示小細胞患者中Chk1與E2F1及Wee1表達呈正相關,Wee1表達與小細胞肺癌患者預后呈正相關,Chk1表達與預后呈負相關。結論:Chk1抑制劑在體內和體外實驗中均表現(xiàn)出對小細胞肺癌特別是p53突變的小細胞肺癌明確的抑瘤作用,Chk1抑制劑與順鉑等化療毒性藥物有協(xié)同抑瘤作用。Chk1抑制劑可以逆轉小細胞肺癌的繼發(fā)性耐藥。Ch1抑制劑主要通過Caspase通路和下調E2F1促進腫瘤細胞凋亡。Wee1過表達在Chk1抑制劑繼發(fā)耐藥中起重要作用,Wee1DNA拷貝數、mRNA水平及蛋白水平與繼發(fā)耐藥能力顯著相關。p38MAPK信號通路旁路激活也可能在Chk1抑制劑繼發(fā)性耐藥的形成機制中起到一定的作用。Chk1和Wee1可以成為小細胞肺癌預后生存的預測因子之一。Chk1抑制劑與Wee1抑制劑聯(lián)合應用有可能為小細胞肺癌的治療提供新的治療靶點和治療策略。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2
【圖文】：

28圖 1. 抑制 Chk1 可以增強小細胞肺癌中順鉑介導的腫瘤細胞毒性作用并活化 Caspase-2/3(A-B) 細胞活力實驗：人類小細胞肺癌細胞系在不同試劑處理 72 小時后的腫瘤細胞存活率(A) 1 M 順鉑, 300nM AZD7762, 及兩種藥物聯(lián)合應用(B) 1 M 順鉑, 30nM Chk1 抑制劑

天津醫(yī)科大學博士學位論文 一 Chk1 抑制劑對小細胞肺癌的抑瘤作用prexasertib 及兩種藥物聯(lián)合應用(C) 細胞活力實驗：檢測小細胞肺癌細胞系 GLC4 轉染下列 siRNA：空白 siRNA(siControl), Chk1 (siCHK1), 和/或 Chk2 (siCHK2), 聯(lián)合或不聯(lián)合順鉑 (2.5 M) 處理 72 小時后 (D) 細胞活力實驗：在順鉑存在的情況下，檢測 p53 基因突變型或 p53 基因野生型小細胞肺癌細胞分別轉染 siControl 或 siCHK1 的細胞存活率； 蛋白質印跡法 檢測(E) Chk1, Chk2, cleaved caspase 3 活化片段, (F) GLC4 小細胞肺癌細胞系聯(lián)合或不聯(lián)合順鉑，同時應用 siRNA 轉染后的凋亡相關蛋白的水平。以 -tubulin 作為內參蛋白。 非配對雙截尾 t 檢驗 p 值: *p<0.05; **p<0.005; ns:無顯著性差別。

天津醫(yī)科大學博士學位論文 一 Chk1 抑制劑對小細胞肺癌的抑瘤作用小時給藥，隨后第 24th小時加入順鉑; cisplatin followed by AZD: 順鉑在第 0th小時給藥，隨后 AZD7762 在第 24th小時加入. (B) 柱狀圖顯示在下列相應處理 96 小時后細胞存活率的變化情況（倍數變化），相同實驗重復 3 次，所有數據表示為中位數 標準差。

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本文編號：2776736