【摘要】：腫瘤轉(zhuǎn)移是目前癌癥患者死亡的主要因素,在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中循環(huán)腫瘤細(xì)胞團(tuán)(circulating tumor microemboli,CTM)被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的“種子”,最新的研究顯示CTM具有高的轉(zhuǎn)移潛能,而CTM中包含的不同細(xì)胞類型為CTM的轉(zhuǎn)移潛能提供了有利環(huán)境。因此對CTM中的每一個(gè)細(xì)胞做進(jìn)一步研究有利于揭示腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)是分析單個(gè)細(xì)胞中位于表型末端的轉(zhuǎn)錄組信息,提供了對CTM中的每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析的技術(shù)基礎(chǔ),但是要對CTM中的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析還需要解決以下問題:(1)CTM在患者中的流行率很低,需要構(gòu)建CTM模型來滿足對CTM基礎(chǔ)研究的需求;(2)如何從血液中捕獲到完整的CTM并將CTM解聚為單細(xì)胞且不影響細(xì)胞中的RNA水平;(3)如何對分解得到的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確的mRNA定量分析。首先針對CTM來源少的問題,本課題采用了低濃度胰酶消化法和懸浮培養(yǎng)法構(gòu)建了 CTM體外模型,兩種方法均能產(chǎn)生細(xì)胞活性好、穩(wěn)定的CTM模型,但是低濃度胰酶消化法產(chǎn)生的單細(xì)胞數(shù)較細(xì)胞團(tuán)數(shù)多一個(gè)數(shù)量級,懸浮培養(yǎng)法產(chǎn)生的細(xì)胞團(tuán)和單細(xì)胞的數(shù)量相近,因此懸浮培養(yǎng)法產(chǎn)生的細(xì)胞團(tuán)數(shù)所占比例更高。為進(jìn)一步模擬CTM的生理狀態(tài),我們構(gòu)建了荷瘤動物模型,并在荷瘤動物的循環(huán)血中獲得了 CTM體內(nèi)模型。針對CTM前處理的問題,本課題評價(jià)了三種不同的CTM解聚試劑和三種不同的CTM富集方法。在三種不同的CTM解聚試劑的考察中,Tissue(tumor)dissociation/single cell isolation kit 不能完成 CTM 的解聚;胰酶-EDTA 可以在 2 min左右解聚CTM,但是胰酶-EDTA會造成單細(xì)胞中RNA的嚴(yán)重降解;無動物蛋白胰酶替代物可以在2 min左右將CTM解聚為單細(xì)胞,并且經(jīng)無動物蛋白胰酶替代物處理的細(xì)胞中RNA的含量與新鮮細(xì)胞RNA含量沒有顯著差異。在三種CTM富集方法中,負(fù)性篩選方法無法保持CTM的完整性,在富集結(jié)束后CTM均解聚成為了單細(xì)胞;膜過濾的方法能較好保持CTM的完整性,但是回收后的CTM被流體壓力錨定在濾膜上,無法進(jìn)行下步的單細(xì)胞分離;正性分選的方法具有較好的回收率,能較好的保持CTM的完整性,并且可以偶聯(lián)下游的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析。因此我們選擇了正性分選富集CTM并采用無動物蛋白胰酶替代物對CTM進(jìn)行解聚,構(gòu)建了無損的CTM前處理方法。針對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的問題,本課題在已經(jīng)報(bào)道的Beads-seq的基礎(chǔ)上加入了獨(dú)立分子標(biāo)簽(Unique molecular identifiers,UMI),構(gòu)建了 Beads-UMI-seq無偏倚的固相單細(xì)胞cDNA建庫技術(shù),本課題將6 nt的UMI添加在mRNA的捕獲引物上,使得逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA都帶上不同的UMI,并且根據(jù)加入U(xiǎn)MI后的序列我們優(yōu)化了 PCR體系中dATP和dTTP的量,使Beads-UMI-seq的建庫產(chǎn)物可以滿足高通量測序要求。該方法既保留了 Beads-seq高效擴(kuò)增的特點(diǎn),又加入了分子標(biāo)簽達(dá)到校正建庫過程中擴(kuò)增偏差的目的。本課題從CTM體內(nèi)體外模型的建立、CTM前處理方法的建立和無偏倚的固相單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組建庫方法的建立三個(gè)方面構(gòu)建了 CTM轉(zhuǎn)錄組分析的新方法,為進(jìn)一步探究CTM在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用提供了技術(shù)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R73-3

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本文編號：2764071