【摘要】：目的研究偶聯(lián)CD133多肽的酞菁綴合物光敏劑(CD133 polypeptide-phthalocyanine conjugate,CD133-Pc)的光動力治療(Photodynamic therapy,PDT)對人結(jié)腸癌干細胞(Colorectal cancer stem cells,CRC-CSCs)體外生物學特性的影響,并探討相關(guān)分子機制。方法1、CRC-CSCs分離、富集和鑒定。用磁珠分選技術(shù)分離出CD133+的結(jié)腸癌細胞;用結(jié)腸癌干細胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng),富集和擴增CRC-CSCs;用流式細胞儀檢測其表面標志物CD133的表達;用體外極限稀釋法驗證CRC-CSCs的自我更新能力;用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測干性相關(guān)蛋白表達;用裸鼠皮下移植瘤模型驗證CRC-CSCs的致瘤性。2、觀察CD133-Pc細胞內(nèi)吞和亞細胞定位。將CD133-Pc或Pc孵育結(jié)腸癌親本細胞或CRC-CSCs,用熒光探針定位細胞器,用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察CD133-Pc和Pc的細胞內(nèi)吞和亞細胞定位。3、體外光動力治療研究。用不同濃度CD133-Pc或傳統(tǒng)光敏劑處理永生化結(jié)腸上皮細胞、結(jié)腸癌親本細胞或CRC-CSCs后進行激光照射,用Alamar Blue法測定細胞生存活力;用懸浮培養(yǎng)法測定結(jié)腸癌細胞的腫瘤球形成能力和CRC-CSCs的自我更新能力;蛋白質(zhì)免疫印跡檢測相關(guān)機制的蛋白水平變化;2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)孵育后用流式細胞儀檢測ROS水平;用流式細胞儀(AnnexinV/PI染色)檢測細胞凋亡;通過ROS抑制劑和自噬抑制劑驗證ROS和自噬在光動力治療中的作用。4、過表達Notch1。用攜帶嘌呤霉素抗性和過表達Notch1基因的慢病毒載體感染CRC-CSCs,用嘌呤霉素篩選構(gòu)建過表達Notch1的CRC-CSCs穩(wěn)定細胞系。結(jié)果1、經(jīng)磁珠分選和無血清超低粘附懸浮培養(yǎng)從人結(jié)腸癌親本細胞HT29和SW620中分離和富集CRC-CSCs;流式細胞術(shù)檢測CD133表達,分選后HT29和SW620的CD133陽性率分別為86.1%和98.6%;經(jīng)磁珠分選和超低粘附懸浮培養(yǎng)后,HT29和SW620的CD133、c-Myc、Nanog、Oct-4蛋白水平增加;裸鼠移植瘤實驗證實CRC-CSCs較親本細胞具有高兩個數(shù)量級的致瘤性。2、CRC-CSCs比結(jié)腸癌親本細胞內(nèi)吞CD133-Pc效率高;在結(jié)腸癌親本細胞中,高表達CD133的細胞內(nèi)吞CD133-Pc效率高;在CRC-CSCs中,內(nèi)吞CD133-Pc效率高于Pc;CD133-Pc聚集在線粒體、溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。3、隨CD133-Pc的濃度升高,PDT降低結(jié)腸上皮細胞、結(jié)腸癌親本細胞和CRC-CSCs的生存活力,但是CD133-Pc PDT對結(jié)腸癌細胞的殺傷作用大于永生化結(jié)腸上皮細胞;CD133-Pc的殺傷作用強于傳統(tǒng)光敏劑Photosan和未偶聯(lián)CD133的Pc;CD133-Pc PDT對CRC-CSCs的殺傷作用隨激光強度增強而增強;在體外,CD133-Pc PDT 1小時細胞即發(fā)生形態(tài)改變。4、CD133-Pc PDT抑制結(jié)腸癌親本細胞的腫瘤球形成和CRC-CSCs的自我更新能力;CD133-PcPDT降低CRC-CSCs中的Notch1和Nanog蛋白水平;過表達Notch1的CRC-CSCs抵抗CD133-Pc PDT。5、經(jīng)不同濃度CD133-Pc對CRC-CSCs進行光動力處理,流式細胞儀檢測結(jié)果顯示細胞內(nèi)ROS水平隨CD133-Pc濃度增加而增高;同時Nrf2和Keap1蛋白水平隨CD133-Pc濃度增高而增高;添加ROS抑制劑后能夠逆轉(zhuǎn)CD133-Pc PDT對CRC-CSCs的生存活力的抑制作用。6、經(jīng)不同濃度CD133-Pc對CRC-CSCs進行光動力處理,流式細胞儀檢測結(jié)果顯示細胞的凋亡比例隨CD133-Pc濃度增加而增高。7、經(jīng)不同濃度CD133-Pc對CRC-CSCs進行光動力處理,免疫熒光結(jié)果顯示隨CD133-Pc濃度增加,LC3表達逐漸增多;蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示CD133-Pc PDT促進CRC-CSCs的自噬;添加自噬抑制劑后能夠逆轉(zhuǎn)CD133-Pc PDT對CRC-CSCs的生存活力的抑制作用。結(jié)論1.通過磁珠分選CD133+細胞和懸浮培養(yǎng)法分離和富集的CRC-CSCs具有結(jié)腸癌干細胞特性。2.CD133-Pc PDT在體外能夠有效殺傷CRC-CSCs。3.CD133-Pc PDT的殺傷作用的機制是細胞通過內(nèi)吞CD133-Pc后,經(jīng)激光照射產(chǎn)生ROS,抑制Notch信號通路,進而抑制結(jié)腸癌干細胞的干性特征和誘導細胞程序性死亡。
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.35
【圖文】：

ＰＣｓ和ＳＷ６２０邋ＰＣｓ中培養(yǎng)出ＣＲＣ－ＣＳＣｓ，即ＨＴ２９ＣＳＣｓ和ＳＷ６２０ＣＳＣｓ。ＣＲＣ－ＣＳＣｓ逡逑在體外培養(yǎng)條件下７天能完全形成腫瘤球，與未經(jīng)超低粘附懸浮培養(yǎng)的ＰＣｓ形成逡逑明顯的形態(tài)學差異（圖１）。逡逑ＨＴ２９邋ＣＳＣｓ邐ＨＴ２９邋ＰＣｓ逡逑Ｄａｙ１邐Ｄａｙ邋３邐Ｄａｙ邋７逡逑＞邋＾邋＇邋＇邋、Ｊ邋，逡逑＼邐ｙ／．邐卜、逡逑：＞邐：；Ａ：邋）邐３逡逑ｌｌ邐＾邐，邋＇Ｙ」逡逑ＳＷ６２０邋ＣＳＣｓ邐ＳＷ６２０邋ＰＣｓ逡逑Ｄａｙ邋１邐Ｄａｙ邋３邐Ｄａｙ邋７逡逑＿＿邋ｌ邋［邐＾邐z1邋ｆ邋ｒ，邋0逡逑圖１來源于ＨＴ２９和ＳＷ６２０的ＣＲＣ－ＣＳＣｓ腫瘤球形成。用無血清超低粘附懸浮培養(yǎng)法從逡逑ＨＴ２９和ＳＷ６２０細胞培養(yǎng)出ＣＲＣ－ＣＳＣｓ。左側(cè)照片顯示不同的時間（天）腫瘤球的形成情況。逡逑原放大倍數(shù)：２００＞＜。右側(cè)照片顯示親本細胞生長情況。原放大倍數(shù)：２０0ｘ。逡逑３．邋１．２邋ＣＲＣ－ＣＳＣｓ邋的鑒定逡逑用抗ＣＤ１３３的ＰＥ熒光抗體標記ＨＴ２９邋ＰＣｓ和ＳＷ６２０邋ＰＣｓ細胞。經(jīng)磁珠分逡逑選后用流式細胞儀檢測細胞的ＣＤ１３３的陽性率。結(jié)果顯示ＨＴ２９和ＳＷ６２０的結(jié)逡逑腸癌干細胞表面標志物ＣＤ１３３＋的細胞分別約占細胞總數(shù)的８６．１％和９８．６％邋（圖逡逑１３邐＿逡逑

圖２結(jié)腸癌干細胞的鑒定。Ａ：流式細胞術(shù)檢測磁珠分選前后ＨＴ２９和ＳＷ６２０的結(jié)腸癌干逡逑細胞表面標志物ＣＤ１３３的細胞陽性率。Ｂ：蛋白質(zhì)免疫印跡分析比較ＣＲＣ－ＰＣｓ和ＣＲＣ－ＣＳＣｓ逡逑中ＣＤ１３３和ｃ－Ｍｙｃ的蛋白水平。Ｃ：激光共聚焦顯微鏡觀察比較ＣＲＣ－ＰＣｓ和ＣＲＣ－ＣＳＣｓ中逡逑Ｎａｎｏｇ，邋Ｏｃｔ－４的表達，原放大倍數(shù)６３0ｘ。Ｄ：第２５代ＳＷ６２０ＣＳＣｓ用無血清超低粘附懸浮逡逑培養(yǎng)法將ＳＷ６２０邋ＣＳＣｓ連續(xù)傳代２５代。照片顯示不同的時間（天）腫瘤球的形成情況。原放逡逑大倍數(shù)：２０0ｘ。Ｅ：邋ＰＣｓ邋和邋ＣＳＣｓ邋體外成球能力比較。將邋ＨＴ２９ＰＣｓ，ＳＷ６２０ＰＣｓ，ＨＴ２９ＣＳＣＳ逡逑和ＳＷ６２０邋ＣＳＣｓ分別以每孔５００、１００、２０、４個細胞接種在超低粘附９６孔板中，無血清培逡逑養(yǎng)７天。照片和柱狀圖顯示腫瘤球的形成情況。原放大倍數(shù)：２００＞＜。逡逑

２４小時后檢測細胞生存活力。ＮＣＭ４６０的ＩＣ５0值為３．１７７ｐＭ，明顯逡逑高于結(jié)腸癌細胞的邋ＩＣ５０值（ＨＴ２９：邋１．８８邋ｐＭ，邋ＳＷ６２０：邋１．５６｜ａＭ，ＨＣＴ１１６：邋１．０９ｐＭ，逡逑ＬｏＶｏ：邋０．８７｜＿ｉＭ）（圖３）。表明ＣＤ１３３－ＰＣ對結(jié)腸癌細胞更具殺傷力。逡逑１８逡逑

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 趙萍;王攀;王筱冰;;程序性細胞死亡與腫瘤[J];生命科學;2011年04期

本文編號：2760892