【摘要】：目的:胃癌的發(fā)生發(fā)展是一種多機制多因素參與的復(fù)雜過程,基因事件在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著越來越重要的作用,多基因的參與可能是腫瘤發(fā)展過程的重要機制。有研究表明,骨髓基質(zhì)細胞抗原2(Bone marrow stromal cell antigen 2,BST2)基因在多種腫瘤中均有表達上調(diào)的現(xiàn)象,可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程,BST2抗體治療可抑制腫瘤生長,這些結(jié)果提示BST2可以通過改變癌細胞的生物學特性,促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。然而,BST2在胃癌發(fā)病過程中的作用機制仍未清晰,有待進一步研究。本研究應(yīng)用免疫組織化學技術(shù)檢測BST2蛋白在胃癌組織及相應(yīng)的癌旁正常胃粘膜組織的表達情況,并分析BST2蛋白表達與胃癌患者臨床病理資料的關(guān)系。通過RNA干擾技術(shù)沉默胃癌細胞的BST2基因,觀察胃癌細胞的體外生物學行為的變化,包括細胞周期、增殖、凋亡及侵襲遷移的影響,并進一步探討是否參與PI3K/Akt/NF-κB信號通路及EMT轉(zhuǎn)化導(dǎo)致了胃癌細胞的侵襲遷移。由此探討B(tài)ST2基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用,期望BST2成為藥物治療胃癌的新靶點,為今后胃癌的基因治療研究提供新的思路。研究方法:1、采用免疫組化法檢測BST2在95例石蠟包埋胃癌組織及76例相應(yīng)癌旁組織中的表達差異。結(jié)合患者的臨床病理資料,分析BST2表達與患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分化、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期等臨床病理參數(shù)的關(guān)系。2、設(shè)計并合成2條針對BST2的siRNA,應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法干擾BST2表達水平較高的兩種胃癌細胞SGC7901和MGC803,實驗分為未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組、BST2-siRNA1組、BST2-siRNA2組,兩種細胞平行進行后續(xù)實驗,觀察各組胃癌細胞的生物學行為。(1)、增殖和周期:MTT法檢測各組細胞轉(zhuǎn)染后24、36、48、72小時的細胞增殖情況,流式細胞儀檢測各組細胞周期的分布,Western blot檢測各組細胞中細胞周期蛋白cyclinA、cyclin D1的表達情況。(2)、凋亡:流式細胞儀檢測和Hoechst染色觀察各組細胞凋亡情況;Western blot檢測各組細胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、pro-caspase3和cleaved-caspase3的表達情況;MTT法檢測梯度濃度的順鉑處理下細胞的存活情況,得出各組細胞的增殖抑制率,計算出各組藥物的IC50,并用IC50濃度的化療藥順鉑處理細胞,通過流式細胞儀和Hoechst染色檢測細胞凋亡,評估化療藥物的敏感性。(3)、侵襲遷移:Transwell實驗檢測各組細胞侵襲能力,細胞劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力;Western blot和明膠酶譜分別檢測各組細胞中促侵襲轉(zhuǎn)移蛋白MMP2和MMP9的表達水平和活性;3、侵襲遷移機制研究:(1)、Western blot檢測各組細胞信號通路相關(guān)蛋白Akt、p-Akt、IκB-α、p-IκB-α、胞核NF-κB p65蛋白的表達,免疫熒光染色觀察NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位情況;免疫細胞化學分析各組細胞EMT轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白Snail、Slug、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Fibronectin的表達。(2)、選擇BST2表達水平較低的胃癌細胞BGC823和HGC27,轉(zhuǎn)染BST2過表達載體并加入Akt信號通路抑制劑LY294002,實驗分為未轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染+LY294002組、空載體對照組、BST2過表達載體轉(zhuǎn)染組、BST2過表達載體轉(zhuǎn)染+LY294002組。Transwell實驗檢測各組胃癌細胞的侵襲能力,細胞劃痕實驗檢測各組細胞的遷移能力;Western blot檢測各組細胞中信號通路相關(guān)蛋白Akt、p-Akt、IκB-α、p-IκB-α及胞核NF-κB p65的表達及EMT轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白Snail、Slug的表達。結(jié)果:1、BST2蛋白在胃癌組織和癌旁正常胃粘膜組織均可見表達,陽性表達主要定位于細胞膜,少量在細胞質(zhì)。胃癌組織中BST2蛋白的陽性表達率高于相應(yīng)的癌旁正常組織,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);患者的年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處器官轉(zhuǎn)移與BST2的蛋白表達水平的相關(guān)性差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),但TNM分期為I期的患者BST2蛋白的表達水平高于II及III期的患者,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2、四種胃癌細胞BST2表達量由高到低分別為SGC7901、MGC803、BGC823、HGC27。在SGC7901及MGC803細胞,與未轉(zhuǎn)染組及陰性對照組相比,BST2-siRNA1組和BST2-siRNA2組細胞增殖明顯減慢,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);細胞周期均被阻滯在G2-M期,S期細胞明顯降低,細胞增殖受到抑制,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);細胞周期相關(guān)蛋白cyclin A和cyclin D1的表達量降低明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);細胞凋亡的數(shù)量和比例上升,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達量降低明顯,而cleaved-caspase3和Bax的表達量顯著上升,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。應(yīng)用IC50濃度的順鉑處理各組細胞后,細胞凋亡的數(shù)量和比例也同樣上升;細胞侵襲和遷移能力下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);侵襲遷移相關(guān)蛋白MMP2和MMP9的表達水平和活性下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3、(1)、在胃癌細胞SGC7901及MGC803,與未轉(zhuǎn)染組及陰性對照組相比,BST2-siRNA1組和BST2-siRNA2組細胞p-Akt、IκBα、胞核NF-κB p65蛋白的表達下降,p-IκB-α表達量上升;免疫熒光染色觀察NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位減少;免疫細胞化學分析結(jié)果示Snail、Slug、N-cadherin、Vimentin、Fibronectin的表達升高,E-cadherin表達下降。(2)、胃癌細胞BGC823和HGC27轉(zhuǎn)染過表達載體后,Western blot結(jié)果示,與未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染空載體對照組相比,BST2的mRNA和蛋白表達升高,細胞的侵襲和遷移能力提高;信號通路相關(guān)蛋白p-Akt、p-IκBα及胞核NF-κB p65的表達升高,IκBα表達降低;EMT轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白Snail、Slug的表達升高;與BST2過表達+LY294002組相比,BST2的m RNA和蛋白表達下降,細胞的侵襲和遷移能力下降,信號通路相關(guān)蛋白p-Akt、p-IκB-α及胞核NF-κB p65的表達降低,IκBα表達升高,EMT轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白Snail、Slug的表達降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:1、BST2蛋白在胃癌組織中高表達。2、BST2的表達可以促進胃癌細胞的增殖、減少凋亡、增加侵襲遷移能力。3、BST2參與PI3K/Akt/NF-κB信號通路及EMT轉(zhuǎn)化促進胃癌細胞的侵襲遷移。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2
【圖文】：

P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。3 結(jié)果3.1 胃癌和癌旁組織中 BST2 的表達情況由于實驗過程中的損耗，最終納入研究的病例標本數(shù)目為：胃癌組織95 例，癌旁正常組織標本 76 例。將這些胃癌組織和癌旁正常組織標本根據(jù)免疫組化評分標準進行評定。在 95 例胃癌組織中，63 例染色陽性（66.32%例染色陰性（33.68%）；在 76 例癌旁正常組織中，31 例染色陽性（40.80%45 例染色陰性（59.21%）；BST2 蛋白在胃癌組織中的表達率為 66.32%（63/明顯高于其相應(yīng)的癌旁正常胃粘膜組織 40.80%（31/76），且差異具有統(tǒng)計義（p<0.01）。

中國醫(yī)科大學博士學位論文3 結(jié)果3.1 篩選 BST2 高表達的胃癌細胞和干擾效果較好的 BST2-siRNA 并沉默胃癌細胞 BST2 的表達3.1.1 SGC7901、MGC803、BGC823、HGC27 胃癌細胞中 BST2 的表達差異分別通過 Real-time PCR 和 Western blot 檢測 SGC7901、MGC803、BGC823、HGC27胃癌細胞中BST2 mRNA和蛋白的表達水平，從高到低依次為：SGC7901、MGC803、BGC823、HGC27。篩選出了 SGC7901、MGC803 兩種 BST2 相對表達量較高的胃癌細胞進行后續(xù)實驗。A B C

25Western blot 檢測檢測 SGC7901 和 MGC803 各組胃癌細胞 BST2 蛋白的表達水平轉(zhuǎn)染組相比，control-siRNA 組細胞中 BST2 蛋白表達無明顯變化(P>0.05)，RNA1 組和 BST2-siRNA2 組細胞中 BST2 mRNA 相對表達量明顯下降(P＜0.05)�？誳ntrol-siRNA 組、BST2-siRNA1 組、BST2-siRNA2 組與內(nèi)參β-actin 比值分別為：1 組細胞：2.04±0.32、2.19±0.46、0.74±0.45、0.81±0.50；MGC803 組細胞：0.66±0.09、3、0.27±0.17、0.15±0.09。（***P＜0.001）制 BST2 表達對 SGC7901 和 MGC803 胃癌細胞增殖和周期的TT 法檢測各組細胞的增殖情況

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本文編號：2758591