【摘要】：研究背景:毛囊位于體表,是皮膚的附屬器之一,常常受到外界環(huán)境中物理、化學(xué)和生物因素的作用,而發(fā)生病理改變,如:脫發(fā)和失去色素。研究表明毛囊中含有間充質(zhì)干細胞(Human hair follicle-derived mesenchymal stem cells,hHF-MSCs)、黑色素干細胞、神經(jīng)嵴干細胞和角朊干細胞。這些干細胞在時空上協(xié)同作用,維持毛囊的自我更新和毛囊周期的正常運行。同其它來源的間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)類似,hHF-MSCs表達CD44、CD73、CD90、CD105,具有成骨、成脂和成軟骨分化潛能。我們成功地利用人毛囊來源干細胞原位修復(fù)了慢性皮膚潰瘍,治愈了白癜風(fēng),構(gòu)建了組織工程小口徑血管,制備出表達產(chǎn)物釋放可控轉(zhuǎn)基因干細胞,成功地逆轉(zhuǎn)了糖尿病高血糖。盡管干細胞在再生醫(yī)學(xué)中的作用越來越引起世人的關(guān)注,但干細胞的安全性、有效性和倫理是干細胞生物學(xué)與再生醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用不可回避的現(xiàn)實問題。特別是干細胞的安全性問題一直備受醫(yī)務(wù)工作者關(guān)注~([1])。研究發(fā)現(xiàn),MSCs通過分泌免疫因子和炎癥因子,抑制或促進腫瘤的生長。但hHF-MSCs是否通過旁分泌,具有促進或抑制腫瘤生長作用,目前尚未見報道。毛囊干細胞來源豐富、獲取方便且可重復(fù)獲取等優(yōu)勢,成為組織修復(fù)、器官重建和基因治療重要的種子細胞來源。為了發(fā)揮毛囊干細胞來源優(yōu)勢,充分利用毛囊干細胞在再生醫(yī)學(xué)中作用,探究毛囊干細胞促進或抑制腫瘤生長作用具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。Toll樣受體(TLRs)是指免疫細胞和非免疫細胞在質(zhì)膜或細胞內(nèi)(內(nèi)小體)表達的Ⅰ型膜蛋白。免疫細胞指的是T、B細胞以及固有免疫細胞(主要包括單核/巨噬細胞、NK細胞、中性粒細胞和肥大細胞等)。非免疫細胞指各種上皮、內(nèi)皮細胞、MSCs等等~([1])。雖然TLRs在免疫系統(tǒng)廣泛分布,但是不同來源細胞的TLRs表達水平并不相同。研究表明人脂肪組織間充質(zhì)干細胞(AT-MSCs)和人骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs)表達TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6和TLR9。雖然BM-MSCs和AT-MSCs均表達TLR4,但臍帶來源的間充質(zhì)干細胞(Wharton Jelly-derived stem cells,WJ-MSCs)缺乏TLR4的表達~([2-5])。一些配體可以特異性與TLRs結(jié)合受體,激活其下游通路,產(chǎn)生活性氧(ROS)的、釋放細胞因子,進而產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。通過利用Poly I:C激活TLR3受體,使MSCs向MSC2表型極化,釋放抗炎因子IL4、IL10、CSF1、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3,維持組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定;利用脂多糖LPS激活TLR4受體,使MSCs向MSC1表型極化,釋放促炎因子IL6、CXCL8、IL1β、TNFα引起局部炎癥反應(yīng),殺滅、清除炎癥部位的病原體及異物等。由此可見利用外來配體與MSCs上TLR3和TLR4特異性結(jié)合,來間接調(diào)控微環(huán)境,調(diào)控腫瘤細胞的增殖和凋亡~([6-8])。鑒于MSCs的極化與TLRs表達有關(guān),我們以體外誘導(dǎo)hHF-MSCs表達TLR4或TLR3,使其極化為hHF-MSC1和hHF-MSC2為出發(fā)點,探討極化后的hHF-MSCs是否具有抑制或者促進黑色素瘤細胞(B16)增殖或凋亡作用。目的:體外誘導(dǎo)HF-MSCs向hHF-MSC1或hHF-MSC2極化,探討hHF-MSC1或和hHF-MSC2對黑色素瘤B16細胞增殖和凋亡作用。方法:1.通過直接拔取志愿者毛發(fā)的方式獲取毛囊的方法,獲得hHF-MSCs。采用免疫熒光染色結(jié)合流式細胞技術(shù),檢測hHF-MSCs表面標志物CD44、CD73、CD90、CD105的表達。利用油紅O和茜素紅染色檢染色檢測hHF-MSCs的成脂、成骨分化潛能。2.通過分別與LPS和Poly I:C作用,誘導(dǎo)hHF-MSCs極化為hHF-MSC1和hHF-MSC2。采用細胞免疫熒光染色結(jié)合流式細胞技術(shù)以及Western blot檢測hHF-MSC1和hHF-MSC2上TLR3和TLR4表達。利用PCR技術(shù)檢測,在mRNA水平檢測hHF-MSC1或hHF-MSC2促炎癥因子和抗炎癥因子表達。利用MTT和流式細胞技術(shù)檢測hHF-MSC1和hHF-MSC2細胞增殖和周期的改變,并與hHF-MSCs比較。3.將hHF-MSC1或hHF-MSC2的上清與B16細胞共培養(yǎng)。利用MTT和細胞免疫熒光技術(shù)檢測hHF-MSC1或hHF-MSC2上清對黑色素瘤B16增殖和凋亡影響。結(jié)果:1.hHF-MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定通過直接拔取志愿者頭部后枕部毛囊,獲得hHF-MSCs。顯微鏡下觀測hHF-MSCs呈長梭形,魚群樣生長。免疫熒光染色以及流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)hHF-MSCs表達CD44、CD73、CD90、CD105,不表達CD31。油紅O及茜素紅染色顯示,hHF-MSCs具有成脂、成骨分化潛能。2.毛囊間充質(zhì)干細胞極化及相關(guān)炎癥因子的檢測在LPS或Poly I:C作用下,hHF-MSCs極化成hHF-MSC1或hHF-MSC2。免疫熒光及流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn):在LPS或Poly I:C作用下,hHF-MSCs表達TLR4或TLR3的百分比增加,與未極化組比,具有顯著性差異。Western blot結(jié)果與流式細胞儀檢測結(jié)果類似。PCR檢測發(fā)現(xiàn)LPS和Poly I:C分別上調(diào)促炎因子IL6、CXCL8、IL1β、TNFα和抗炎因子IL10、CSF1、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3的表達。QPCR檢測發(fā)現(xiàn)LPS和Poly I:C分別上調(diào)促炎因子CXCL8、TNFα和抗炎因子IL10、TGFβ1的表達。MTT檢測發(fā)現(xiàn)在給定的劑量下,LPS和Poly I:C對hHF-MSCs增殖影響與對照組比無顯著差異。3.毛囊間充質(zhì)干細胞極化對黑色素瘤B16增殖凋亡的影響收集hHF-MSC1、hHF-MSC2、hHF-MSCs的同化培養(yǎng)基,與黑色素瘤細胞B16共培養(yǎng)。MTT和細胞免疫熒光技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)hHF-MSC1同化培養(yǎng)基抑制黑色素瘤細胞B16細胞的增殖,促進其凋亡;而hHF-MSC2同化培養(yǎng)基促進黑色素瘤B16細胞的增殖,抑制其凋亡,與hHF-MSCs同化培養(yǎng)基比,均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:通過LPS或Poly I:C誘導(dǎo)hHF-MSCs向hHF-MSC1或hHF-MSC2極化。hHF-MSC1或hHF-MSC2通過旁分泌作用抑制小鼠黑色素瘤B16細胞增殖、促進凋亡作用或促進B16細胞增殖,抑制其凋亡。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.5
【圖文】：

18.2 hHF-MSCs 的鑒定.2.1 hHF-MSCs 細胞表面標志物檢測（細胞免疫熒光）細胞免疫熒光染色結(jié)果顯示， hHF-MSCs 表達 CD105、CD90、CD73 和44，不表達 CD31。結(jié)果圖 2 所示。第 8 代 hHF-MSCs第 8 代 hHF-MSCsA.通過拔取志愿者毛發(fā)，采用組織塊發(fā)培養(yǎng) hHF-MSCs 6 天后，有成纖維樣細胞爬出(100養(yǎng)后 hHF-MSCs 呈長梭形，魚群樣排列。培養(yǎng)第 8 代 hHF-MSCs(B.40×C.100×)

1.3.2.2 hHF-MSCs 細胞表面標志物檢測（流式細胞術(shù)）流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，hHF-MSCs 表達 CD44、CD90、CD105 和 CD73，陽性率分別為 86.94%、89.58%、91.25%、 89.86%，而基本不表達 CD31 內(nèi)皮細胞標志物，如圖 3 所示。圖 2 免疫熒光顯示 hHF-MSCs 表達 CD44、CD90、CD73、CD105, 不表達 CD31（100×）

1.3.2.2 hHF-MSCs 細胞表面標志物檢測（流式細胞術(shù)）流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，hHF-MSCs 表達 CD44、CD90、CD105 和 CD73，陽性率分別為 86.94%、89.58%、91.25%、 89.86%，而基本不表達 CD31 內(nèi)皮細胞標志物，如圖 3 所示。圖 2 免疫熒光顯示 hHF-MSCs 表達 CD44、CD90、CD73、CD105, 不表達 CD31（100×）

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 Martha L Arango-Rodriguez;Fernando Ezquer;Marcelo Ezquer;Paulette Conget;;Could cancer and infection be adverse effects of mesenchymal stromal cell therapy?[J];World Journal of Stem Cells;2015年02期

2 Pranela Rameshwar;;Would cancer stem cells affect the future investment in stem cell therapy?[J];World Journal of Experimental Medicine;2012年02期

3 王青云;;細胞與疾病的關(guān)系[J];中國社區(qū)醫(yī)師(綜合版);2007年02期

本文編號：2757444