【摘要】：目的:通過向體外條件培養(yǎng)液培養(yǎng)成骨前體細胞施加力學載荷,建立前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的細胞力學生物學模型;篩選出前列腺癌骨轉(zhuǎn)移導(dǎo)致病理性成骨分化細胞的差異表達mRNA和miRNA(微小RNA);篩選預(yù)測病理性成骨分化相關(guān)的信號分子和信號通路;預(yù)測防控前列腺癌骨轉(zhuǎn)移所致病理性成骨分化或骨形成的分子靶標,探討前列腺癌骨轉(zhuǎn)移所致病理性成骨分化的機理。方法:1.以前列腺癌PC-3細胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠成骨前體細胞MC3T3-E1,同時采用四點彎曲加載裝置向以上成骨前體細胞施加2500με的周期性力學載荷,作為細胞病理性成骨分化組(病理組);向未經(jīng)條件培養(yǎng)液處理的成骨前體細胞施加2500με的周期性載荷,作為細胞生理性成骨分化組(生理組)。2.檢測相關(guān)成骨分化指標,建立前列腺癌骨轉(zhuǎn)移所致病理性成骨分化的細胞模型。3.采用高通量測序技術(shù),篩選病理性和生理性成骨分化狀態(tài)細胞的差異表達miRNA,并以qRT-PCR(實時熒光定量PCR)驗證。4.采用數(shù)字基因表達譜測序,篩選生理組和病理組差異表達mRNA,采用基因聚類分析、GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析,篩選與前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細胞所致病理性成骨分化相關(guān)的基因以及關(guān)鍵信號途徑,預(yù)測與病理性成骨相關(guān)的分子靶點和信號途徑。結(jié)果:1.相對于生理組,病理組的堿性磷酸酶活性和染色、成骨分化相關(guān)基因/蛋白(Runx 2(Runt-相關(guān)蛋白-2)、I型膠原、骨鈣素)表達量均下調(diào)(*P0.05)。2.采用高通量測序技術(shù),篩選出51個差異表達的miRNA;q RT-PCR驗證其中差異顯著的24個miRNA,發(fā)現(xiàn)7個miRNAs上調(diào),12個miRNAs下調(diào),且qRT-PCR與測序篩選結(jié)果相符。3.采用基因聚類分析、GO數(shù)據(jù)庫分析和KEGG Pathway分析,篩選出可能與前列腺癌骨轉(zhuǎn)移所致病理性成骨分化相關(guān)的基因以及關(guān)鍵信號途徑。結(jié)論:成骨細胞在生理力學載荷下,PC-3條件培養(yǎng)液培養(yǎng)抑制成骨細胞的成骨分化,建立了前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的細胞力學生物學模型;在此模型基礎(chǔ)上,篩選并驗證7個上調(diào)、12個miRNAs下調(diào)的miRNA,篩選出WNT、MAPK、TNF等8條信號途徑及相關(guān)基因、miRNA很可能與前列腺癌骨轉(zhuǎn)移導(dǎo)致病理性成骨分化相關(guān)。
【學位授予單位】：桂林醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.25
【圖文】：

四點彎曲力學加載裝置；B：裝置簡圖：加載時，細胞 Four-point bending device for application of mechanical B:Device diagram: cell tension during loading培養(yǎng)單元的消毒膠對培養(yǎng)空間和加載板子進行黏合處理，確中不出現(xiàn)培養(yǎng)基泄漏；硅橡膠處理過的加載H 溶液過夜浸泡；清水清洗、晾干，接著使取出晾干，再使用清水過夜浸泡，撈出、晾酒精小心擦拭以后，放入超凈工作臺，打開干加載板孔。細胞種板

圖 2A MC3T3-E1 成骨細胞培養(yǎng)（10 X） 圖 2B PC-3 細胞培養(yǎng)（10 X）Figure 2A Culture of MC3T3-E1(10 X） Figure 2B Culture of PC-3 (10 X）2.2 成骨細胞分化相關(guān)指標檢測分別采用市售試劑盒，檢測堿性磷酸酶活性和染色；熒光定量 PCR檢測或免疫印跡法檢測成骨分化相關(guān) mRNA/蛋白（Runx-2、I 型膠原、骨鈣素）；茜素紅染色細胞外基質(zhì)的鈣質(zhì)沉積。2.2.1 力學刺激下條件培養(yǎng)的成骨前體細胞 ALP 檢測細胞以適當密度接種于加載孔中，待細胞完全融合后，分別給細胞施加周期性力學載荷，病理組同時用 PC-3 條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天予以更換培養(yǎng)液。加載第三天后，檢測各組細胞堿性磷酸酶表達差異，如圖3，病理組較生理組堿性磷酸酶活性明顯減少。

圖 2A MC3T3-E1 成骨細胞培養(yǎng)（10 X） 圖 2B PC-3 細胞培養(yǎng)（10 X）Figure 2A Culture of MC3T3-E1(10 X） Figure 2B Culture of PC-3 (10 X）2.2 成骨細胞分化相關(guān)指標檢測分別采用市售試劑盒，檢測堿性磷酸酶活性和染色；熒光定量 PCR檢測或免疫印跡法檢測成骨分化相關(guān) mRNA/蛋白（Runx-2、I 型膠原、骨鈣素）；茜素紅染色細胞外基質(zhì)的鈣質(zhì)沉積。2.2.1 力學刺激下條件培養(yǎng)的成骨前體細胞 ALP 檢測細胞以適當密度接種于加載孔中，待細胞完全融合后，分別給細胞施加周期性力學載荷，病理組同時用 PC-3 條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天予以更換培養(yǎng)液。加載第三天后，檢測各組細胞堿性磷酸酶表達差異，如圖3，病理組較生理組堿性磷酸酶活性明顯減少。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 劉復(fù)州;邱浩;王汝杰;鄒傳奇;劉栓得;胡旭;沈偉偉;張超;周躍;初同偉;;不同前列腺癌細胞對成骨前體細胞增殖和成熟能力的影響[J];腫瘤;2013年12期

2 湯元杰;孫穎浩;許傳亮;王林輝;高旭;劉冰;紀家濤;;前列腺癌PC-3細胞條件培養(yǎng)液對人骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化的影響[J];中華男科學雜志;2011年03期

3 閆玉仙;宋梅;郭春;郭勇;宮元偉;李瑞欣;張西正;;基底拉伸應(yīng)變對小鼠三種骨組織細胞BMP-2 mRNA表達的影響[J];中國老年學雜志;2010年21期

本文編號：2750592