【摘要】：乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,也是全世界最常見的三大惡性腫瘤之一,是導(dǎo)致女性死亡的主要原因。目前,乳腺癌是一全身性疾病已得到共識,早期即可全身轉(zhuǎn)移。盡管治療手段的進(jìn)步提高了乳腺癌的生存率,但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的重要原因。20%-30%的乳腺癌患者會發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,并且發(fā)生轉(zhuǎn)移后乳腺癌患者中位生存期僅僅只有2年。三陰性乳腺癌(triple-negativebreast cancer,TNBC)即雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor2,HER2)均為陰性,通常有更高的組織學(xué)分級,并且伴隨TP53突變,預(yù)后差。由于其受體陰性,不適于內(nèi)分泌治療及Her2靶向治療,臨床上主要采取手術(shù)聯(lián)合化療的方法,但該類乳腺癌患者生存率明顯低于其他類型乳腺癌患者。因此為該類患者尋找更加有效的治療方式尤為重要。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程,大致可概括為三個(gè)過程,即轉(zhuǎn)移起始過程、轉(zhuǎn)移進(jìn)展過程、轉(zhuǎn)移毒力(致病)過程。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在轉(zhuǎn)移起始和進(jìn)展過程均有非常重要的作用。在轉(zhuǎn)移起始過程,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化使腫瘤細(xì)胞失去上皮細(xì)胞極性,脫離原發(fā)灶,侵入間質(zhì),進(jìn)入血管。在轉(zhuǎn)移進(jìn)展過程,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化支持循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞存活并溢出血管、定居在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移器官。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指特定的生理、病理狀況下,上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化,從而增強(qiáng)細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)能力。在機(jī)體病理狀態(tài)下,尤其是腫瘤中,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化扮演重要角色。乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT后侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。EMT過程重要的分子事件是E-cadherin表達(dá)下調(diào),N-cadherin和Vimentin表達(dá)上調(diào)。因此可通過檢測這三個(gè)分子來驗(yàn)證是否發(fā)生 EMT。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin-syetem,RAS)是人體體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)的重要組成部分。RAS系統(tǒng)包含著多種多肽、酶、及受體,調(diào)節(jié)人體血壓、水和電解質(zhì)平穩(wěn)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)除了調(diào)節(jié)人體水和電解質(zhì)平衡以及血壓平穩(wěn)外,RAS系統(tǒng)與細(xì)胞增生、凋亡、炎癥、血管新生、腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。腎素原(prorenin)、腎素(renin)及其受體腎素(原)受體((pro)reninreceptor,PRR)是RAS系統(tǒng)重要組成部分,有越來越多的證據(jù)表明PRR與腫瘤的發(fā)生和血管新生有著密切聯(lián)系。PRR是由350個(gè)氨基酸組成的跨膜區(qū)域蛋白,由Nguyen等發(fā)現(xiàn)和成功克隆,其編碼基因叫做ATP6ap2/PRR,位于人X染色體上(Xp11.4)。它通過與腎素和腎素原結(jié)合而發(fā)揮生理和病理作用。有文獻(xiàn)報(bào)道PRR在乳腺癌組織及細(xì)胞中高表達(dá),并且阻斷(P)RR,乳腺癌細(xì)胞生長也受到抑制,但是具體機(jī)制不詳。因此,我們設(shè)想PRR能否促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖,并通過影響EMT促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。目的:檢測PRR對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響以及與EMT的關(guān)系。方法:1.采用免疫組化檢測PRR在乳腺癌組織和癌旁組織是否有表達(dá)差異。采用免疫熒光法檢測乳腺癌組織,明確PRR的定位。2.分別以 human-PRR-siRNA 和 negatlive control-siRNA 轉(zhuǎn)染 MCF-7 細(xì)胞株。然后以Westem blot,PCR法檢測PRR,根據(jù)PRR表達(dá)情況不同,將乳腺癌細(xì)胞株分成實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組(MCF-7-PRR-si):PRR被SiRNA沉默的乳腺癌MCF-7細(xì)胞;對照組(MCF-7-NC):未沉默PRR的乳腺癌MCF-7細(xì)胞。3.CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測MCF-7細(xì)胞增殖能力。4.Transwe實(shí)驗(yàn)檢測MCF-7細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。5.Westem blot,PCR 法檢測 EMT 標(biāo)志物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)蛋白和mRNA表達(dá)情況。6.免疫組化檢測β-catenin在乳腺癌組織和癌旁組織的表達(dá)。結(jié)果:1.免疫組化表明PRR在癌組織和癌旁組織均有表達(dá)。但在癌組織中的表達(dá)比癌旁組織明顯增高;進(jìn)一步的免疫熒光表明PRR主要表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞而不是間質(zhì)。2.CCK-8實(shí)驗(yàn)示相同時(shí)間和條件下,實(shí)驗(yàn)組(MCF-7-PRR-si)OD值要小于對照組(MCF-7-NC)OD值,提示實(shí)驗(yàn)組(MCF-7-PRR-si)細(xì)胞生長速度慢。3.Transwell侵襲結(jié)果示實(shí)驗(yàn)組(MCF-7-PRR-si)穿出小室的MCF-7細(xì)胞細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組(MCF-7-NC)(p0.05)。transwell遷移實(shí)驗(yàn)示,實(shí)驗(yàn)組(MCF-7-PRR-si)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)目少于對照組(MCF-7-NC)(p0.05),提示對照組MCF-7細(xì)胞侵襲和遷移能力強(qiáng)。4.Western blot檢測示:實(shí)驗(yàn)組(MCF-7-PRR-si)E-cadherin蛋白表達(dá)高于對照組(MCF-7-NC),而 N-cadherin、Vimentin 表達(dá)低于對照組(MCF-7-NC)。PCR示:實(shí)驗(yàn)組E-cadherin mRNA表達(dá)高于對照組(MCF-7-NC),而N-cadherin和Vimentin mRNA表達(dá)低于對照組(MCF-7-NC)。5.免疫組化顯示β-catenin在癌組織表達(dá)高于癌旁組織。結(jié)論:PRR可通過調(diào)節(jié)EMT促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞株的侵襲和轉(zhuǎn)移。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

定目標(biāo)分子的定性及相對定量分析。免疫組化顯示ＰＲＲ在正常乳腺導(dǎo)管上皮和逡逑乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織均有表達(dá)，但在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)水平明顯高逡逑于癌旁（圖１）。為進(jìn)一步確定ＰＲＲ在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織的表達(dá)部位，對乳逡逑腺浸潤性導(dǎo)管癌組織的石蠟切片進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，對ＰＲＲ和ＣＤ３１邋（血管內(nèi)逡逑皮標(biāo)志物）進(jìn)行熒光共定位分析（圖２），顯示ＰＲＲ邋（綠色）主要在乳腺癌細(xì)胞逡逑表達(dá)，而在間質(zhì)不表達(dá)。（圖２中ＣＤ３１顯示為紅色，ＰＲＲ顯示為綠色，藍(lán)色顯逡逑示細(xì)胞核）逡逑癌旁邐浸潤性lY管癌逡逑圖１ＰＲＲ在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌癌組織和癌旁組織的表達(dá)（Ｘ邋１00）逡逑Ｆｉｇｌ邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＰＲＲ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｂｒｅａｓｔ邋ｉｎｖａｓｉｖｅ邋ｄｕｃｔａｌ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ａｎｄ逡逑ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｔｉｓｓｕｅ邋（邋Ｘ邋ｌ00）邋．邋（ｓｃａｌｅｓ邋ｒｅｐｒｅｓ

圖３乳腺浸潤型導(dǎo)管癌組織和癌旁組織ＨＥ染色（Ｘ４０）逡逑Ｆｉｇ３邋Ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ＨＥ邋ｉｎ邋ｂｒｅａｓｔ邋ｉｎｖａｓｉｖｅ邋ｄｕｃｔａｌ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ａｎｄ邋ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅ邋（邋Ｘ逡逑４０）邋．（ｓｃａｌｅｓ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｌＯＯｕｍ）逡逑２邋ＰＲＲ沉默結(jié)果逡逑分別以邋ｈｕｍａｎ－ＰＲＲ－ｓｉＲＮＡ邋和邋ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡ邋轉(zhuǎn)染邋ＭＣＦ－７邋細(xì)胞，再以邋Ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑Ｂｌｏｔ和ＲＴ－ＰＣＲ分別檢測ＭＣＦ－７細(xì)胞ＰＲＲ蛋白及ｍＲＮＡ，確定ＰＲＲ在乳腺癌ＭＣＦ－７細(xì)胞逡逑中的沉默結(jié)果。然后根據(jù)ＰＲＲ情況將ＭＣＦ－７細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。圖４Ａ為乳腺癌逡逑ＭＣＦ－７邋細(xì)胞以邋ｈｕｍａｎ－ＰＲＲ－ｓｉＲＮＡ邋和邋ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡ邋處理后邋ＰＲＲ邋蛋白的邋Ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑Ｂｌｏｔ結(jié)果。顯示為實(shí)驗(yàn)組ＰＲＲ蛋白表達(dá)較對照組降低；圖４Ｂ進(jìn)一步表示經(jīng)過逡逑ｈｕｍａｎ－ＰＲＲ－ｓｉＲＮＡ處理后，實(shí)驗(yàn)組ＰＲＲ明顯下降（ｐ＜０邋．邋０５邋）；圖４Ｃ為經(jīng)過逡逑ｈｕｍａｎ－ＰＲＲ－ｓｉＲＮＡ邋和邋ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡ邋轉(zhuǎn)染乳腺癌邋ＭＣＦ－７邋細(xì)胞后，ＰＲＲｍＲＮＡ邋表達(dá)逡逑情況�？煽闯觯簩�(shí)驗(yàn)組ＰＲＲｍＲＮＡ較對照組明顯下降（Ｐ＜０．邋００１）。轉(zhuǎn)染成功后為進(jìn)行后逡逑續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。逡逑

通過使用酶標(biāo)儀在４５０ｎｍ波長處測定ＯＤ值來反映活細(xì)胞數(shù)量。逡逑在相同條件下，分別在２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ對實(shí)驗(yàn)組（ＭＣＦ－７－ＰＲＲ－ｓｉ）和對照逡逑組（ＭＣＦ－７－ＮＣ）在４５０ｎｍ處測定０Ｄ值，如圖５所示，紅色曲線代表實(shí)驗(yàn)組逡逑（ＭＣＦ－７－ＰＲＲ－ｓｉ），藍(lán)色曲線代表對照組（ＭＣＦ－７－ＮＣ）。在７２ｈ時(shí)，實(shí)驗(yàn)組逡逑（ＭＣＦ－７－ＰＲＲ－ｓｉ）邋０Ｄ邋值為邋１．７１４±０．３０９，而對照組（ＭＣＦ－７－ＮＣ）邋０Ｄ邋值為逡逑２．８９６±０．２６４。實(shí)驗(yàn)組０Ｄ值明顯小于對照組，即實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)少于對照組細(xì)胞逡逑數(shù)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｔ＝－５．０４２，Ｐ＜０．０１）。從而說明實(shí)驗(yàn)組（ＭＣＦ－７－ＰＲＲ－ｓｉ）逡逑細(xì)胞增生能力明顯下降。因此，ＰＲＲ可顯著促進(jìn)乳腺癌ＭＣＦ－７細(xì)胞的增殖。逡逑ＭＣＦ－７－ＰＲＲ－ｓｉ逡逑４￣｜邐ＭＣＦ－７－ＮＣ逡逑ｉｒｋ逡逑丨：：ｙ逡逑ＵＴ１Ｉ１Ｉ１Ｉ１Ｉ逡逑０邐２０邐４０邐６０邐８０逡逑Ｔｉｍｅｓ（ｈｏｕｒｓ）逡逑圖５邋ＰＲＲ調(diào)節(jié)乳腺癌ＭＣＦ－７細(xì)胞的增殖逡逑Ｆｉｇ５邋ＰＲＲ邋ｍｏｄｕｌａｔｅｓ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｂｒｅａｓｔ邋ｃａｎｃｅｒ邋ＭＣＦ－７邋ｃｅｌｌｓ邋ｂｙ邋ＣＣＫ８邋ａｓｓａｙ逡逑２６逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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2 楊麗華;沈星凱;李靜秋;楊杰;樂燕萍;龔朝輝;;微RNA通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響腫瘤轉(zhuǎn)移[J];遺傳;2014年07期

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本文編號：2746508