【摘要】：前列腺癌是威脅人類健康的主要癌癥之一,在歐洲和美國(guó),前列腺癌的發(fā)病率多年來(lái)一直位居男性惡性腫瘤的首位,死亡率居第二位。雖然中國(guó)前列腺癌發(fā)病率低于歐美等國(guó)家,但近年來(lái),隨著人口老齡化、飲食結(jié)構(gòu)改變、醫(yī)療診斷技術(shù)水平的提高和醫(yī)療體檢的普及,我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)估計(jì),2015年我國(guó)前列腺癌新發(fā)病例約60300例,死亡病例約26600例。前列腺癌的傳統(tǒng)的治療為雄激素剝奪療法,利用藥物或手術(shù)方法降低病人的體內(nèi)雄激素水平,從而達(dá)到治療前列腺癌的目的。遺憾的是,在經(jīng)過(guò)12-18個(gè)月的中位治療時(shí)間后,大多數(shù)病人最終轉(zhuǎn)歸為去勢(shì)/激素抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)。一旦出現(xiàn)激素抵抗,就目前的治療水平來(lái)說(shuō),激素抵抗性前列腺癌對(duì)化學(xué)治療和放射治療皆不敏感,從而導(dǎo)致CRPC患者面臨內(nèi)分泌治療無(wú)效后生活質(zhì)量降低、生存期縮短等一系列影響。因此,研發(fā)新的有效的前列腺癌治療藥物和治療手段成為CRPC前列腺癌治療中亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。近年來(lái),基于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、改變細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑等機(jī)制的分子靶向治療、基因治療方法受到人們的重視,如國(guó)內(nèi)外學(xué)者楊高毅等研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)bcl-2蛋白可以誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡,并且發(fā)現(xiàn)bcl-2反義寡核苷酸oblimersensodium聯(lián)合多烯紫杉醇治療激素難治性前列腺癌的Ⅰ/Ⅱ期臨床研究也顯示出良好的治療效果。另外,攜帶可溶性人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)基因的腺病毒可引起人體內(nèi)腫瘤細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡。其中,TRAIL引起了人們的關(guān)注。國(guó)內(nèi)外對(duì)TRAIL及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的研究表明,TRAIL或其胞外域降解形成可溶性的細(xì)胞因子sTRAIL(Soluble TRAIL)可作用于靶細(xì)胞表面的死亡受體DR4和DR5而形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體,并激活caspase8及其下游的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),然后啟動(dòng)死亡受體途徑和線粒體依賴的凋亡途徑。其中死亡受體途徑最終通過(guò)激活caspase3等效應(yīng)酶,作用于蛋白激酶C(PKC)等底物而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而線粒體依賴途徑是通過(guò)形成有活性的tBid(truncated BID),使線粒體釋放cytC等凋亡相關(guān)因子,再通過(guò)caspase3,7誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。bcl2是該途徑的抑制因子之一。另外,一些腫瘤細(xì)胞高表達(dá)誘騙受體DcR1、DcR2,它們可與DR4/DR5競(jìng)爭(zhēng)同TRAIL的結(jié)合,抑制TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,使腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)TRAIL的耐受。然而,近年來(lái),盡管人類等脊椎動(dòng)物TRAIL蛋白的抗癌作用已有較多研究報(bào)道,但對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞的促凋亡作用則罕見(jiàn)報(bào)道,對(duì)其作用的詳細(xì)的分子機(jī)制則未見(jiàn)報(bào)道,而對(duì)貝類等無(wú)脊椎動(dòng)物的TRAIL基因及其重組蛋白的抗腫瘤功能國(guó)際上則更沒(méi)有報(bào)道。在先前利用RT-PCR技術(shù)克隆池蝶蚌的免疫相關(guān)基因的過(guò)程中,我們獲得了雙殼貝類池蝶蚌的可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(sTRAIL)基因的部分序列,并發(fā)現(xiàn)該TRAIL有一定的抗腫瘤特性。為深入探討貝類sTRAIL基因的抗腫瘤作用及其可能的作用機(jī)制,我們擬通過(guò)本項(xiàng)目的研究進(jìn)一步確定池蝶蚌的sTRAIL在抗腫瘤,即促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞PC3細(xì)胞凋亡方面的功能作用,并揭示其作用的死亡受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑等可能的作用機(jī)制,從而將該蛋白作為新型抗癌藥物,以及將TRAIL和相關(guān)信號(hào)分子作為靶向治療的有效靶點(diǎn)運(yùn)用于前列腺癌等癌癥的治療實(shí)踐方法:1.利用RT-PCR和western-blot技術(shù)克隆池蝶蚌sTRAIL基因序列,并對(duì)sTRAIL基因進(jìn)行原核表達(dá)、純化獲得多克隆抗體。2.利用不同濃度的(10ng-10 u g)河蚌sTRAIL重組蛋白對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)刺激,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)和DNAladder等檢測(cè)法對(duì)sTRAIL誘導(dǎo)刺激0-96h后PC3的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象進(jìn)行了分析。3利用Real-time實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting技術(shù)檢測(cè)sTRAIL重組蛋白誘導(dǎo)/未誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞(PC-3)的DR4、DR5、DcR1、DcR2在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)變化。4 分別用 caspase8 抑制劑 Z-AEVD-FMK 和 caspase3 抑制劑 Ac-DEVD-CHO 處理經(jīng)sTRAIL誘導(dǎo)的PC-3細(xì)胞,利用上述方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,并檢測(cè)抑制劑處理前后caspase8、caspase3、PKC等分子在mRNA和蛋白水平表達(dá)的變化。5在上述對(duì)死亡受體、caspase信號(hào)途徑研究的基礎(chǔ)上,用PKC抑制劑,Staurosporine處理經(jīng)sTRAIL誘導(dǎo)的PC-3細(xì)胞,利用Real-time實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和抑制劑處理前后PKC等基因表達(dá)的變化。6.檢測(cè)sTRAIL誘導(dǎo)后,PC-3細(xì)胞中抗凋亡因子bcl-2基因表達(dá)水平的變化。用bcl-2抑制劑(ABT-737,5nM)處理后,再次檢測(cè)凋亡率。結(jié)果:1克隆了池蝶蚌sTRAIL蛋白序列,并證實(shí)了 sTRAIL蛋白對(duì)PC3細(xì)胞的毒性作用。2河蚌sTRAIL對(duì)PC3細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用,可誘導(dǎo)PC3細(xì)胞發(fā)生顯著的細(xì)胞凋亡,隨著sTRAIL濃度和誘導(dǎo)時(shí)間的增加,PC3細(xì)胞的凋亡率逐漸增加,呈現(xiàn)明顯的劑量與時(shí)間效應(yīng),其中100ngsTRAIL誘導(dǎo)組中,24h細(xì)胞凋亡率可達(dá)23.7%以上,并可檢測(cè)到DNA ladder的形成。3對(duì)sTRAIL誘導(dǎo)后,PC3細(xì)胞中死亡受體DR4和DR5均有表達(dá),但DR4較高;而誘騙受體DcR1和DcR2不表達(dá).4 sTRAIL誘導(dǎo)可引起caspase8、caspase3基因表達(dá)水平的顯著上調(diào),同時(shí)伴隨凋亡率的增加;用caspase8抑制劑Z-IETD-FMK或caspase 3抑制劑Ac-DEVD-CHO分別處理,均能顯著下調(diào)凋亡率。5sTRAIL誘導(dǎo)可引起PKC基因表達(dá)水平的上調(diào),但不顯著;PKC抑制劑(Saurosporine)處理后,凋亡率明顯下降,但仍顯著高于對(duì)照組。6sTRAIL誘導(dǎo)后24h內(nèi)可引起bcl-2表達(dá)上調(diào),但不顯著;用bcl-2抑制劑(ABT-737)處理后,凋亡率明顯增加。結(jié)論:確定了池蝶蚌sTRAIL對(duì)前列腺癌細(xì)胞株(PC3)的促凋亡作用,并分析了sTRAIL誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞株(PC3)發(fā)生細(xì)胞凋亡的死亡受體途徑中相關(guān)的死亡受體、caspases、PKC、Bcl-2等分子的作用,確定了 TRAIL、DR4和bcl-2可作為PC3細(xì)胞靶向治療的新靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.25
【圖文】：

結(jié)果逡逑２．１邐ＲＮＡ提取逡逑提取了河蚌的總ＲＮＡ，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖１所示。可看到逡逑兩條以上的條帶，分別為５Ｓ和１８ＳｒＲＮＡ，說(shuō)明所提取的ＲＮＡ完整性較好。另逡逑夕卜，經(jīng)過(guò)測(cè)定，實(shí)驗(yàn)中提取的總ＲＮＡ的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０全部在２．０左右，這也逡逑表明我們所提取的ＲＮＡ的純度較氋。逡逑}楨義賢跡保遙危撂崛〗峁治鰣義嫌鏡潰焙停玻哄澹遙危燎碇塹纈窘峁義希玻插危螅裕遙粒桑袒虻模校茫依┰鰣義弦隕鮮鱟埽遙危練醋嫉玫降模悖模危廖０澹茫校茫依┰齷竦昧私擔(dān)埃埃猓皰義洗笮〉鈉危ㄈ繽跡菜荊�，符猴@て�。辶x希灣澹卞義稀觥觥鰣義希玻瑰義

本文編號(hào)：2744840