【摘要】：目的:腸道粘膜免疫系統(tǒng)作為全身免疫系統(tǒng)的重要組成部分,深刻影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。通過口服腫瘤疫苗的模式重塑腸道粘膜免疫,進而誘導系統(tǒng)性抗腫瘤免疫保護作用,這可能是一種全新的腫瘤免疫途徑。腫瘤細胞來源的微顆粒(tumor cell-derived microparticles,T-MPs)是當腫瘤細胞受到外界刺激或發(fā)生凋亡時,通過改變細胞骨架結構而向胞外釋放的一類直徑位于100到1OOOnm之間、由細胞膜包裹細胞質內容物的囊性小泡。我們前期的研究已經證實T-MPs同時攜帶有腫瘤抗原和DNA等固有免疫信號分子,其特有的脂筏結構具有極好的理化穩(wěn)定性,且將T-MPs作為疫苗進行皮下免疫獲得了理想的效果。在此基礎上,本研究將T-MPs作為口服疫苗,深入探索T-MPs介導的腸道粘膜免疫系統(tǒng)的改變,闡明腸道抗腫瘤免疫應答的相關機制,為開發(fā)新型口服腫瘤疫苗提供可能。方法:(1)為了證明口服T-MPs能體內抑制腫瘤生長,我們分別提取B16-MPs和CT-26-MPs 口服免疫小鼠,再皮下接種相應腫瘤細胞,繪制腫瘤生長曲線;為了證明口服T-MPs引起的免疫反應具有抗原特異性,我們用OVAB16-MPs、B16-MPs和Ovalbumin 口服免疫小鼠,再皮下接種OVAB16細胞;為證明T-MPs比腫瘤細胞裂解物和凋亡腫瘤細胞更具優(yōu)勢,我們用B16-MPs、B16細胞裂解物和凋亡B16細胞口服免疫小鼠,再皮下接種B16細胞;用B16-MPs 口服免疫裸鼠研究T-MPs介導的免疫應答類型。(2)為了探索口服T-MPs是否能介導腸道局部和全身性T細胞免疫應答,我們用B16-MPs 口服免疫小鼠,使用流式細胞染色檢測脾臟和腸系膜淋巴結(MLN)IFN-γ+的CD8+和CD4+T細胞比例以及其他CD4+ T細胞亞群的比例,使用qPCR檢測相關細胞因子的表達;利用口服免疫OVAB16-MPs再分離淋巴細胞進行體外二次刺激的方式,流式檢測IFN-γ的產生,證明T-MPs可在體內誘導特異性T細胞。(3)建立小鼠體內DCs條件性清除和重建模型,通過流式檢測IFN-γ+的CD8+和CD4+T細胞比例判斷T-MPs誘導的T細胞免疫是否被啟動,研究DCs是否參與T-MPs介導的抗腫瘤T細胞免疫。(4)為了研究T-MPs在腸道的攝取情況,給小鼠口服PKH26-T-MPs,于多個時間點流式檢測不同腸段細胞對T-MPs的攝取情況;將腸道細胞分為CD45+免疫細胞和CD45-非免疫細胞兩類,使用流式和免疫熒光的方法檢測PKH26-T-MPs被何種細胞攝取;利用細胞骨架抑制劑秋水仙堿研究腸上皮細胞(IECs)對T-MPs的轉吞作用。(5)先給小鼠口服H22-MPs,再用流式和免疫熒光的方法檢測腸道CD11c+,CD103+以及CD3+CD8+細胞的比例,研究T-MPs對腸道免疫細胞的動員情況;同時用qPCR和ELISA從基因和蛋白水平檢測IECs趨化因子的表達,研究腸道免疫細胞的遷移是否與趨化因子有關。(6)為探索IECs產生趨化因子的信號傳導問題,我們使用Western blot和免疫熒光的方法檢測攝取了 H22-MPs的IECs內MAPK和NF-κB的活化情況,并利用MAPK和NF-κB抑制劑反向證明;為進一步研究MAPK和NF-κB信號的上游分子,我們通過qPCR和Western blot檢測攝取了 H22-MPs的IECs內NOD受體的表達,并用基因敲除鼠再次檢測MAPK和NF-κB的活化、趨化因子的表達、免疫細胞的募集和口服T-MPs的腫瘤生長抑制作用。結果:(1)將B16-MPs和CT-26-MPs分別口服免疫小鼠,再皮下接種相應腫瘤細胞,結果B16-MPs和CT-26-MPs在不同品系的小鼠都有很好的腫瘤生長抑制作用;口服免疫OVAB16-MPs比B16-MPs和Ovalbumin有更顯著的抗OVAB16腫瘤作用;口服免疫B16-MPs比相應細胞裂解物和凋亡細胞能更有效地抑制B16腫瘤的生長;口服B16-MPs在裸鼠體內不能抑制腫瘤生長。(2)用B16-MPs 口服免疫小鼠后,發(fā)現MLN和脾臟分泌IFN-γ的CD8+和CD4+ T細胞比例增加,而CD4+ T細胞其他亞群的比例沒有改變,且Th1相關細胞因子表達上調;分離口服OVAB16-MPs、B16-MPs和Ovalbumin小鼠的淋巴細胞進行體外OVA肽二次刺激時,OVAB16-MPs組可產生更多IFN-γ。(3)用DT清除CD11c-DTR小鼠的DCs,再通過額外DCs的過繼進行重建,結果顯示DCs的清除不改變IFN-γ+ T細胞的比例,而DCs的重建恢復了 T-MPs誘導的IFN-γ+T細胞的比例增加。(4)給小鼠灌胃PKH26-T-MPs,發(fā)現T-MPs在1h被回腸攝取最多,且攝取了 T-MPs的細胞主要是IECs,而CD11c+CD103+DCs只攝取少部分;使用秋水仙堿抑制IECs的轉吞作用,發(fā)現DCs獲取的T-MPs是由IECs釋放而來。(5)小鼠口服H22-MPs后,發(fā)現回腸細胞中CD11c+,CD103+以及CD3+CD8+細胞的比例增加;同時回腸IECs會在基因和蛋白水平上調表達趨化因子CCL2,CCL20和CX3CL1,其中CCL2上調程度顯著且維持時間最長。(6)發(fā)現攝取了 T-MPs的IECs胞內的ERK和p38的磷酸化水平增加,NF-κB入核,使用抑制劑能阻斷CCL2的上調表達;攝取了 T-MPs的IECs胞內的NOD2受體在基因和蛋白水平均上調表達,在NOD2敲除小鼠體內,MAPK和NF-κB的活化、CCL2的表達增加、CD103+DCs和CD8+T細胞的遷移募集以及口服T-MPs抑制腫瘤生長的現象均被阻斷。結論:T-MPs經口服途徑到達腸道后,大部分能夠被回腸上皮細胞攝取,一方面,T-MPs與IECs胞內的NOD2受體作用,活化下游的MAPK和NF-κB信號,導致以CCL2為主的趨化因子的上調表達和釋放,進而募集CD103+DCs;另一方面,T-MPs被IECs經轉吞作用從腸腔面轉運到基底面,從而被遷移來的CD103+DCs捕獲并抗原提呈,引發(fā)腸道粘膜局部和全身系統(tǒng)性抗腫瘤T細胞免疫應答。T-MPs作為腫瘤口服疫苗不僅具有有效性和廣譜性,且比其他腫瘤疫苗成分具有更大優(yōu)勢。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R730.51
【圖文】：

再給所有組小鼠皮下接種Ｂ１６腫瘤細胞。結果顯示，與ＰＢＳ對照組相比，只有逡逑口服免疫Ｂ１６－ＭＰＳ能顯著抑制Ｂ１６腫瘤生長，而口服免疫Ｂ１６細胞裂解物和逡逑凋亡Ｂ１６細胞卻沒有抗腫瘤效果（圖３）。這說明口服Ｔ－ＭＰｓ比口服其他腫瘤疫逡逑苗成分能介導更強大的免疫保護作用，暗示了通過口服途徑，Ｔ－ＭＰｓ比其他腫逡逑瘤疫苗成分具有更大優(yōu)勢。逡逑３６逡逑

再給所有組小鼠皮下接種Ｂ１６腫瘤細胞。結果顯示，與ＰＢＳ對照組逡逑相比，口服Ｂ１６－ＭＰＳ并不能介導與之前實驗結果相似的抗腫瘤免疫效應，對Ｂ１６逡逑腫瘤的生長無抑制作用（圖４）。這說明當小鼠體內沒有Ｔ細胞時，口服Ｔ－ＭＰｓ逡逑的抗腫瘤效應便不能發(fā)揮，暗示了口服Ｔ－ＭＰｓ疫苗介導的免疫保護作用是Ｔ細逡逑胞依賴的。逡逑３７逡逑

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本文編號：2742102