【摘要】：研究背景食管鱗癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一,在我國每年約有477,900新發(fā)病例和375,000的食管鱗癌死亡患者,嚴重威脅人類健康。因此,早期診斷和早期治療是改善食管鱗癌預后、降低死亡率的關鍵。臨床上,用于食管鱗癌的診斷方法主要包括鋇餐、胃鏡、組織活檢及血清傳統(tǒng)腫瘤標志物等檢查。目前,鋇餐是食管鱗癌早期篩查最常用的手段,但由于其敏感性低不易發(fā)現(xiàn)食管內微小的病變,對食管鱗癌的早期診斷具有一定的局限性;雖然胃鏡檢查及組織活檢是食管鱗癌診斷的金標準,但該檢查方法的有創(chuàng)性限制了其在食管鱗癌篩查中的廣泛應用;目前血清中SCCA和CYFRA21-1是臨床常用于食管鱗癌檢腫瘤標志物,但其對食管鱗癌早期檢查敏感性和特異性均較低。因此,尋找敏感性高和特異性好的可靠腫瘤標志物是臨床亟待解決的難題。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在多種腫瘤組織及細胞中均有著不同程度的表達失調,并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移等多種生物學過程密切相關。同時,lncRNA可以外泌體(exosome)或蛋白復合物形式進入血液循環(huán)系統(tǒng),形成循環(huán)lncRNA被發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定存在于血清或其他人體體液。因此,這為尋找循環(huán)系統(tǒng)血清游離或exosomal lncRNAs作為腫瘤的無創(chuàng)診斷及預后監(jiān)測的新型生物標志物提供了新思路。本課題首先通過文獻檢索獲得與食管鱗癌相關差異表達的lncRNAs作為候選lncRNAs,運用熒光實時定量PCR檢測技術在食管鱗癌患者組織及配對癌旁組織進行驗證候選lncRNAs表達量,以篩選出差異明顯的lncRNAs在血清及其exosome檢測循環(huán)lncRNAs的表達情況,進一步篩選出食管鱗癌血清exosomal lncRNAs差異表達譜,結合回歸分析構建食管鱗癌診斷模型并評價其在食管鱗癌早期診斷的應用價值;同時通過Kaplan-Meier和Cox回歸分析分別對食管鱗癌患者進行預后生存和獨立因素分析;最后選取在血清exosome診斷價值最高的lncRNA UCA1在血清中檢測其表達量并評估其在食管鱗癌的診斷效能。本研究將建立基于循環(huán)lncRNAs表達譜的食管鱗癌診斷模型并對其預后評估,為食管鱗癌的無創(chuàng)診斷及預后監(jiān)測開辟新途徑。第一部分基于血清exosomallncRNAs表達譜的食管鱗癌診斷模型的建立及臨床意義研究目的食管鱗癌是世界上常見的具有侵襲性的惡性腫瘤之一,尋找用于早期診斷的高效標志物是迫切需要的。越來越多的研究表明,exosomallncRNA可作為腫瘤診斷潛在穩(wěn)定的標志物。本研究旨在篩選血清來源的exosomal lncRNA表達譜用于食管鱗癌診斷及預后監(jiān)測。方法1.從食管鱗癌患者和健康對照組血清分離提取exosome,并通過透射電子顯微鏡、免疫印跡技術等多種方法鑒定exosome。2.篩選階段,采用熒光定量實時PCR(qRT-PCR)在34對食管鱗癌患者組織及癌旁對照組織中檢測篩選來自文獻報道的24個食管鱗癌相關的差異表達lncRNAs。3.確證階段,將差異表達lncRNAs在202對食管鱗癌患者及健康對照組血清exosome檢測,建立食管鱗癌的診斷模型并評價其診斷效能。4.驗證階段,在另外111對血清exosome進一步驗證lncRNAs診斷模型的診斷價值并評估預后獨立因素。結果1.在食管鱗癌組織共篩選出20個差異表達lncRNAs。2.確證階段,4 個 lncRNAs(UCAl、POU3F3、ESCCAL-1和PEG10)在食管鱗癌血清exosome均存在顯著差異表達,且表達均上調。采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)評估UCA1、POU3F3、ESCCAL-1和PEG10診斷食管鱗癌的受試者工作曲線下面積(AUC)分別為0.733(95%可信區(qū)間(CI)為0.687～0.776),0.717(95%CI 為 0.670～0.760),0.676(95%CI 為 0.628～0.720),0.648(95%CI 為0.599～0.694)。通過logistic回歸分析構建基于4個lncRNAs表達譜的食管鱗癌血清exosome診斷模型,此診斷模型的診斷效能為0.844。3.驗證階段,通過qRT-PCR再次驗證,食管鱗癌exosomal lncRNA診斷模型的診斷效能為0.853(95%CI為0.799～0.897),其中敏感性及特異性分別為80.20%和80.20%。其對食管鱗癌TNMⅠ-Ⅱ、Ⅲ診斷AUC為0.820和0.935,顯著高于SCCA 相應的 AUC:0.652 和 0.642(P0.001)。4.此外,Kaplan-Meier分析表明,高表達UCA1和POU3F3食管鱗癌患者比低表達患者的生存率低(P0.001)。多變量Cox回歸分析顯示lncRNA POU3F3可作為食管鱗癌獨立預后因素(P=0.004)。結論1.血清 exosomal lncRNA 表達譜(UCA1、POU3F3、ESCCAL-1 和 PEG10)可作為食管鱗癌診斷的新型穩(wěn)定腫瘤標志物。2.血清exosomalPOU3F3可用于食管鱗癌預后監(jiān)測的獨立因素。第二部分血清lncRNAUCAl在食管鱗癌中的表達及臨床意義目的食管鱗癌是一種生長速度快且侵襲性強的惡性腫瘤之一,早期診斷并及時有效的治療是十分必要的。多項研究表明,循環(huán)lncRNA可作為腫瘤預測的潛在新型標志物。本研究旨在探討lncRNAUCAl在食管鱗癌患者血清的表達及潛在的臨床意義。方法收集96例食管鱗癌患者血清樣本,同時選取96例年齡、性別匹配的健康體檢者作為健康對照組,其中12例食管鱗癌患者行術前、術后比較。采用實時熒光定量PCR檢測lncRNAUCAl在食管鱗癌患者血清中的表達情況,并對食管鱗癌患者術前、術后進行比較。分析食管鱗癌患者血清lncRNA UCA1與其臨床病理參數(shù)的關系,并通過ROC曲線評估血清lncRNA UCA1的診斷效能。結果與健康對照組比較,食管鱗癌患者lncRNA UCA1的表達明顯升高,且術后較術前表達顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。血清lncRNA UCA1診斷食管鱗癌的ROC曲線下面積(AUC)為0.816,其中敏感性和特異性分別為77.1%和76.0%。此外,與SCCA(AUC=0.679)相比,lncRNAUCAl對食管鱗癌的診斷效能更高(P0.001)。結論血清lncRNA UCA1可以作為食管鱗癌早期診斷及術后監(jiān)測潛在的新型腫瘤標志物。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.1;R730.43
【圖文】：

圖１．血清外泌體的特征電子顯微鏡下ｅｘｏｓｏｍｅ的圖片（Ａ）；邋Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ分析逡逑ｅｘｏｓｏｍｅ的分布（Ｂ）；流式細胞儀檢測ｅｘｏｓｏｍｅ表面分子（ＣＤ６３和ＣＤ８１）邋（Ｃ）；逡逑

圖２NｎｃＲＮＡ在食管鱗癌患者和對照組血清外泌體的表達及診斷價值：確證階段，逡逑運用ｑＲＴ－ＰＣＲ邋檢測ＩｎｃＲＮＡ邋ＵＣＡ１邋（Ａ），邋ＰＯＵ３Ｆ３邋（Ｂ），ＥＳＣＣＡＬ－１邋（Ｃ）邋ａｎｄ邋ＰＥＧ１０逡逑（Ｄ）在食管鱗癌患者（ｎ＝２０２）和健康對照組（ｎ＝２０２）血清外泌體的散點圖，逡逑＊＊＊ｐ＜０＿００１。ＲＯＣ曲線分析ＵＣＡ１邋（Ｅ），邋ＰＯＵ３Ｆ３邋（Ｆ），邋ＥＳＣＣＡＬ－１邋（Ｇ），邋ＰＥＧ１０邋（Ｈ）對逡逑食管鱗癌患者的診斷效能，＊＊＊ｐ＜０．００１。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ邋ｖａｌｕｅｓ邋ｏｆ邋ｃａｎｄｉｄａｔｅ邋ＩｎｃＲＮＡ逡逑ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ邋ｉｎ邋ｓｅｒｕｍ邋ｅｘｏｓｏｍｅｓ邋ｆｏｒ邋ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ邋ＥＳＣＣ．邋Ｓｃａｔｔｅｒ邋ｄｏｔ邋ｐｌｏｔｓ邋ｏｆ邋ＵＣＡ１邋（Ａ），逡逑ＰＯＵ３Ｆ３邋（Ｂ）．邋ＥＳＣＣＡＬ－１邋（Ｃ）邋ａｎｄ邋ＰＥＧ邋１０邋（Ｄ）邋ＩｎｃＲＮＡ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ａｎａｌｙｚｅｄ邋ｂｙ逡逑ｑＲＴ－ＰＣＲ邋ａｎｄ邋ＲＯＣ邋ｃｕｒｖｅ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｆｏｒ邋ｔｈｅ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＥＳＣＣ邋ｕｓｉｎｇ邋ＵＣＡ１邋（Ｅ），逡逑ＰＯＵ３Ｆ３邋（Ｆ）？邋ＥＳＣＣＡＬ－１邋（Ｇ），邋ＰＥＧ１０邋（Ｈ）邋ｉｎ邋ｈｅａｌｔｈｙ邋（ｎ＝２０２）邋ａｎｄ邋ＥＳＣＣ邋（ｎ＝２０２）逡逑ｐａｔｉｅｎｔｓ５邋ｓｅｒｕｍ邋ｅｘｏｓｏｍｅｓ邋ｉｎ邋ｔｒａｉｎｉｎｇ邋ｓｅｔ，邋＊＊＊ｐ＜０．００１．逡逑

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