【摘要】：目的:選取合適的人前列腺癌細胞系建立體外失巢凋亡耐受細胞模型,探究CEMIP對前列腺癌細胞失巢凋亡、錨定非依賴性生長、遷移及侵襲能力的影響。方法:用超低粘附細胞培養(yǎng)板(ULAP)懸浮培養(yǎng)人前列腺癌PC-3、DU145、C4-2、LNCa P細胞,流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。Transwell小室法檢測PC-3、DU145、C4-2、LNCa P細胞遷移及侵襲能力。用PC-3和DU145兩種細胞系建立失巢凋亡耐受模型,通過sh RNA沉默CEMIP的表達,CCK-8法檢測親本細胞、失巢凋亡耐受細胞及沉默CEMIP細胞在ULAP中存活及增殖能力。采用流式細胞學檢測沉默CEMIP對失巢凋亡耐受細胞抗凋亡能力的影響。軟瓊脂克隆實驗檢測沉默CEMIP對失巢凋亡耐受細胞錨定非依賴性生長能力的影響。Western blotting法檢測親本細胞、失巢凋亡耐受細胞及沉默CEMIP細胞裂解的CEMIP、PARP和caspase-3蛋白表達量。采用Transwell小室法檢測沉默CEMIP對失巢凋亡耐受細胞遷移及侵襲能力的影響。結(jié)果:通過流式細胞儀對PC-3、DU145、C4-2、LNCa P四種細胞系的檢測表明,PC-3和DU145有一定的失巢凋亡耐受能力,C4-2和LNCa P在懸浮培養(yǎng)條件下凋亡率較高。Transwell小室法表明PC-3和DU145細胞遷移、侵襲能力要高于C4-2和LNCa P;CCK8法表明在懸浮培養(yǎng)條件下失巢凋亡耐受細胞的細胞增殖率顯著高于對應(yīng)親本細胞或沉默CEMIP的細胞;流式細胞學檢測在懸浮培養(yǎng)條件下表明失巢凋亡耐受細胞的凋亡率顯著低于對應(yīng)親本細胞或沉默CEMIP的細胞。軟瓊脂克隆實驗表明沉默CEMIP可顯著抑制失巢凋亡耐受細胞的克隆形成率。Western blotting結(jié)果表明,失巢凋亡耐受細胞的CEMIP表達水平明顯高于對應(yīng)的親本細胞,構(gòu)建的sh RNA可顯著沉默其表達水平。CEMIP高表達可抑制激活型PARP和激活型Caspase-3蛋白表達。Transwell小室法表明沉默CEMIP可抑制失巢凋亡耐受細胞的遷移、侵襲能力。結(jié)論:PC-3和DU145細胞適合建立失巢凋亡耐受的細胞模型,CEMIP可抑制細胞失巢凋亡、促進錨定非依賴性生長、促進細胞遷移和侵襲。目的:研究細胞脫離胞外基質(zhì)狀態(tài)下CEMIP對細胞氧化應(yīng)激水平及谷氨酰胺轉(zhuǎn)運能力的影響。方法:利用sh RNA沉默失巢凋亡耐受細胞CEMIP的表達,用超低粘附培養(yǎng)板懸浮培養(yǎng)細胞一定時間,進行后續(xù)實驗:1、利用熒光探針DCFH-DA對細胞進行染色,通過熒光顯微鏡及流式細胞儀分別檢測細胞ROS水平;2、使用Mito SOXTM紅色試劑染色,熒光顯微鏡下檢測細胞內(nèi)線粒體超氧化物水平;3、單細胞凝膠電泳法檢測細胞DNA損傷水平;4、JC-1熒光探針檢測細胞線粒體膜電位;5、GSH和GSSG檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)GSH/GSSG水平;6、利用CCK8法檢測促氧化劑及抗氧化劑對細胞存活的影響;7、利用谷氨酰胺檢測試劑盒測定不同時間點培養(yǎng)基中谷氨酰胺濃度。另外,分別用含谷氨酰胺培養(yǎng)基和不含谷氨酰胺培養(yǎng)基培養(yǎng)失巢凋亡耐受細胞及CEMIP沉默的細胞,CCK8法檢測谷氨酰胺對細胞存活的影響,GSH和GSSG檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)GSH/GSSG水平變化。結(jié)果:沉默失巢凋亡耐受細胞的CEMIP表達后,在懸浮培養(yǎng)條件下細胞內(nèi)ROS水平顯著增高,線粒體超氧化物水平增高,DNA損傷程度明顯增高,線粒體膜電位下降,GSH/GSSG比率降低。促氧化劑能進一步降低CEMIP沉默后細胞存活率,而抗氧化劑能逆轉(zhuǎn)CEMIP沉默后細胞存活率的下降水平。沉默CEMIP表達后,失巢凋亡耐受細胞對培養(yǎng)基中谷氨酰胺的消耗水平降低。谷氨酰胺剝奪條件下懸浮培養(yǎng)失巢凋亡耐受細胞可導(dǎo)致存活率下降,GSH/GSSG比率降低。結(jié)論:CEMIP可能通過促進細胞谷氨酰胺的攝取從而降低細胞“失巢”狀態(tài)下氧化應(yīng)激水平,促進細胞的存活。目的:研究CEMIP影響谷氨酰胺轉(zhuǎn)運促進前列腺癌細胞失巢凋亡耐受的分子機制方法:實時熒光定量PCR檢測沉默CEMIP后失巢凋亡耐受的前列腺癌細胞谷氨酰胺轉(zhuǎn)運體(SLC1A5、SLC7A5、SLC38A3、SLC38A5)表達量變化。采用western blotting的方法進一步證實SLC1A5蛋白量表達的變化。利用人前列腺癌組織芯片進行免疫組織化學染色,研究SLC1A5蛋白在正常組織與前列腺癌組織中表達量的變化。通過Oncomine和The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫對SLC1A5在前列腺癌及癌旁組織中表達水平差異進行研究,對SLC1A5對前列腺癌生存與后進行研究。采用western blotting法檢測ERK、p-ERK、c-MYC蛋白的表達差異。沉默CEMIP表達后再進行SLC1A5過表達功能實驗,western blotting檢測細胞SLC1A5蛋白表達改變,GSH和GSSG檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)GSH/GSSG水平。結(jié)果:實時熒光定量PCR和western blotting的方法檢測證實沉默CEMIP后SLC1A5的m RNA和蛋白表達量均顯著降低。組織芯片結(jié)果表明前列腺癌組織中SLC1A5的表達量顯著高于癌旁組織。沉默CEMIP后失巢凋亡耐受的前列腺癌細胞中p-ERK、c-MYC蛋白的表達水平降低。沉默CEMIP表達后再進行SLC1A5過表達,結(jié)果表明GSH/GSSG降低的情況可被逆轉(zhuǎn)。結(jié)論:CEMIP通過調(diào)控ERK/c-MYC/SLC1A5通路影響谷氨酰胺轉(zhuǎn)運,從而促進前列腺癌細胞失巢凋亡耐受。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.25

【參考文獻】

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1 冉茂良;高環(huán);尹杰;陳斌;;氧化應(yīng)激與DNA損傷[J];動物營養(yǎng)學報;2013年10期

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1 李濤;BDNF/TrkB通路對前列腺癌細胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移、侵襲、失巢凋亡的影響及分子機制的體外研究[D];華中科技大學;2015年

本文編號：2732260