【摘要】：結直腸癌是世界上常見的消化道惡性腫瘤之一,嚴重危害人類生命健康。近年來,隨著我國居民生活水平的提高,生活方式和飲食結構的改變,結直腸癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢,其發(fā)病率及死亡率均居常見惡性腫瘤前列。目前認為,改善結直腸癌患者預后的主要手段是提高其早期診治率。但結直腸癌的早期診治手段有限,對于晚期患者,治療方案不多且效果欠佳,造成這一窘境的重要原因就是目前結直腸癌的發(fā)病機制尚未完全闡明。目前,基因調控學說、腫瘤干細胞學說和炎癥學說是其發(fā)病機制的主要研究方向�；蛘{控學說已在多項研究中被證實,在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起著至關重要作用。基因的表達受多種因素的影響,近年來,隨著生物信息學、基因測序等技術的發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)circRNA(circular RNA,circRNA)是一類新穎的可在哺乳動物體內能穩(wěn)定表達、具有高度保守序列并能在轉錄或轉錄后水平對基因表達發(fā)揮重要調控作用的內源性非編碼RNA。已有多項研究證實,circRNA的異常表達及調控與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關,這其中包括肝癌、胃癌及結直腸癌等。CircRNA在人體內含量豐富、種類繁多,目前已被研究的circRNA只是極少數(shù),仍有大量具有重要生物學功能的circRNA有待人們挖掘。因此,尋找在結直腸癌中存在差異表達并具有重要生物學功能的circRNA將為闡明結腸癌的發(fā)病機制奠定一定的基礎,為結直腸癌的診治提供新的靶點及思路。目的:篩選并鑒定1個參與結直腸癌進程調控的circRNA方法:1)從高通量測序數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫(Sequence read archive,SRA)中下載已經(jīng)公布的,12對結直腸癌及癌旁組織的RNA測序結果。首先,利用 FASTQ、TopHat2、Find_circ 軟件,結合 UCSC(University of California Santa Cruz)數(shù)據(jù)庫,按設置標準(FDR0.05,Fold change≥2),篩選出在結直腸癌及癌旁組織中差異表達的circRNA。然后通過Targetscan、miRanda、starbase預測差異表達circRNA的調控靶點,選出能夠同時在三款預測軟件中均取得良好預測結果的circRNA,構建他們的共調控網(wǎng)絡。最后應用DAVID、Pathway Studio軟件結合KEEG(Kyoto Encyclopedia Of Genes And Genomes)數(shù)據(jù)庫對他們下游靶基因的潛在生物學功能進行分析。2)利用qRT-PCR檢測上述circRNA在結直腸癌及癌旁組織中的表達水平,選出有顯著差異表達的circRNA。隨后分析他們的circRNA-miRNA-mRNA共表達調控網(wǎng)絡節(jié)點,選定一個circRNA作為進一步研究對象。最后利用瓊脂糖凝膠電泳及連接點測序驗證該circRNA的成環(huán)性,通過RNaseR實驗,驗證其穩(wěn)定性。3)收集40例結直腸癌患者手術標本(癌和癌旁)及相關臨床病理資料,檢測circHIPK3在癌及癌旁組織中的表達情況。結合患者臨床資料,找出與circHIPK3表達水平相關的臨床病理特征。4)培養(yǎng)HT29、SW480、LoVo、CAC02結直腸腫瘤細胞株及正常結腸上皮細胞株(FHC)。檢測不同細胞株中circHIPK3的表達情況,選擇合適細胞株進行進一步功能實驗。構建過表達質粒,瞬時轉染,利用qRT-PCR檢測circHIPK3轉染效率。通過CCK-8、平板克隆、凋亡、劃痕及Transwell實驗驗證circHIPK3功能。最后結合第一部分的生物信息學分析及既往研究,推測circHIPK3的可能調控機制。利用qPCR檢測circHIPK3與可能調控靶miRNA在結直腸癌組織中表達的相關性。結果:1)經(jīng)FASTQ、TopHat2、Find_circ軟件篩選,在RNA測序結果中共找到12個在結直腸癌及癌旁組織中存在差異表達circRNA,其中上調的為6個,下調的6個。能夠同時在三個靶點預測軟件中均取得良好預測結果的 circRNA 共 4 個(hsa_circ_0000284,hsa_circ_0000400,hsa_circ_0000523,hsa_circ_0087960)。GO 及 pathway 分析結果提示,該組circRNA所調控的蛋白主要參與到細胞周期調控、細胞增殖、細胞對藥物的抵抗及組織重塑等生物學過程中,信號通路主要富集于Foxo及P53通路。2)上述 4 個 circRNA 的 qRT-PCR 檢測結果提示,hsa_circ_0000400(circTUBA1B)及 hsa_circ_0000284(circHIPK3)在癌及癌旁組織中存在顯著差異表達(p0.05)。分析circTUBA1B和circHIPK3的circRNA-miRNA-mRNA共表達調控網(wǎng)絡,我們發(fā)現(xiàn)circHIPK3較circTUBA1B有更多的節(jié)點,其具有重要生物學功能的可能性更大,因此選擇circHIPK3為進一步研究對象。瓊脂糖凝膠電泳及連接點測序結果提示,circHIPK3能形成良好的環(huán)狀結構。RNase R結果提示,在RNA分子中加入RNaseR后,circHIPK3仍有較高表達,而mHIPK3表達較對照組顯著下降(p0.05),證實了 circHIPK3的穩(wěn)定性。3)40對結直腸癌及癌旁組織qPCR結果提示,circHIPK3的在結直腸癌組織中的表達較癌旁顯著下調,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結合患者臨床病理資料進行分析發(fā)現(xiàn),circHIPK3的表達水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、分化程度無明顯相關性,而與腫瘤轉移顯著相關(p0.05)。4)細胞實驗結果顯示,circHIPK3在結直腸癌細胞株中的表達水平較FHC細胞株降低,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05),我們選擇了LoVo及SW480細胞株進行進一步功能實驗。質粒瞬轉后,qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)轉染組circHIPK3表達水平較對照組顯著升高。CCK-8、平板克隆、凋亡、劃痕及Transwell實驗結果證實,circHIPK3過表達組細胞株較對照組細胞增殖及遷移能力下降,凋亡比例增加。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),circHIPK3可能是通過circHIPK3-miR-20a-5p-P53軸來參與結直腸癌進程調控的。qPCR結果提示circHIPK3與miR-20a-5p的△CT在結直腸癌組織中呈負相關(r =-0.7378,p = 0.0149)。結論:(1)CircHIPK3在結直腸癌組織及細胞株中的表達下調,低的circHIPK3表達與患者腫瘤轉移相關;(2)CircHIPK3抑制結直腸癌細胞生長和遷移;(3)CircHIPK3可能是一個負性結直腸癌進程調控因子。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.34
【圖文】：

圖１．１差異表達ｃｉｒｃＲＮＡ的火山圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１，１邋Ｖｏｌｃａｎｏ邋ｐｌｏｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｃｉｒｃＲＮＡ逡逑ＮＡ－ｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ共調控網(wǎng)絡的構建逡逑用Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ、ｍｉＲａｎｄａ、Ｓｔａｒｂａｓｅ三款預測軟件對上述差下游ｍｉＲＮＡ及最終調控的ｍＲＮＡ進行預測。同時在三個預測預測靶點的有邋ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００００５２３邋（邋ｃｉｒｃＭＥＴＴＬ３邋），ｈｓａ＿ｃｉｒｃ３），ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００８７９６０邋（ｃｉｒｃＬＰＡＲｌ）及邋ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００００４００邋（ｃｉｒｃＴ果，構建該組ｃｉｒｃＲＮＡ的ｃｉｒｃＲＮＡ－ｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ共調控網(wǎng)示，這些ｃｉｒｃＲＮＡ存在多個可能的ｍｉＲＮＡ結合位點，并可最終參與到基因表達的調控中。逡逑

邐４逡逑Ｆｏｌｄ邋ｃｈａｎｇｅ逡逑圖１．１差異表達ｃｉｒｃＲＮＡ的火山圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１，１邋Ｖｏｌｃａｎｏ邋ｐｌｏｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｃｉｒｃＲＮＡ逡逑３．３邋ＣｉｒｃＲＮＡ－ｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ共調控網(wǎng)絡的構建逡逑同時應用Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ、ｍｉＲａｎｄａ、Ｓｔａｒｂａｓｅ三款預測軟件對上述差異表達的逡逑ｃｉｒｃＲＮＡ的下游ｍｉＲＮＡ及最終調控的ｍＲＮＡ進行預測。同時在三個預測軟件中均逡逑獲得較好預測靶點的有邋ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００００５２３邋（邋ｃｉｒｃＭＥＴＴＬ３邋），ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００００２８４逡逑（ｃｉｒｃＨＩＰＫ３），ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００８７９６０邋（ｃｉｒｃＬＰＡＲｌ）及邋ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００００４００邋（ｃｉｒｃＴＵＢＡｌＢ），逡逑根據(jù)預測結果，構建該組ｃｉｒｃＲＮＡ的ｃｉｒｃＲＮＡ－ｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ共調控網(wǎng)絡，如下逡逑圖。該圖顯示，這些ｃｉｒｃＲＮＡ存在多個可能的ｍｉＲＮＡ結合位點，并可能通過對他逡逑們的調節(jié)，最終參與到基因表達的調控中。逡逑２６逡逑

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 邵婧嫻;朱利芹;馬晶晶;杜楠;何敬東;;結直腸癌特征性環(huán)狀RNA篩選[J];南京醫(yī)科大學學報(自然科學版);2015年11期

本文編號：2731319