【摘要】：背景:乳腺癌是目前全世界女性最常見的惡性腫瘤之一。雖然當(dāng)今乳腺癌的診斷及綜合治療策略包括手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療、免疫治療等正日益突飛猛進(jìn),乳腺癌的臨床療效明顯提高,然而乳腺癌的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍頻繁發(fā)生,導(dǎo)致部分乳腺癌患者預(yù)后較差。明確乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲、增殖、耐藥等生物學(xué)特征的相關(guān)因素和作用機(jī)制,探索乳腺癌新的治療靶點(diǎn)和治療方法仍然迫在眉睫。婆羅雙樹樣基因4(Sal-Like 4,SALL4)是近年發(fā)現(xiàn)的原癌基因,位于人類20號(hào)染色體20q13.13-q13.2區(qū)域,可以編碼SALL4A、SALL4B和SALL4C三種異構(gòu)體蛋白。SALL4在胚胎的早期發(fā)育、器官形成以及胚胎干細(xì)胞增殖、多能性維持和自我更新方面均發(fā)揮著重要的作用,且與遺傳性疾病、白血病、淋巴瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。越來越多的證據(jù)表明SALL4在多種腫瘤中高表達(dá),如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、腎母細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜癌、和生殖細(xì)胞瘤等,并且在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。近年來,國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)對(duì)SALL4的結(jié)構(gòu)、功能、生物學(xué)特征、與非腫瘤及腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系等已有多方面報(bào)道,其中較多的是研究SALL4與造血系統(tǒng)、先天性疾病、生殖細(xì)胞腫瘤等疾病的關(guān)系,對(duì)其與乳腺癌關(guān)系的研究仍然比較缺乏,SALL4在乳腺癌中扮演的角色尚未被闡明。本實(shí)驗(yàn)旨在研究SALL4與乳腺癌生物學(xué)行為的相關(guān)性及其影響乳腺癌阿霉素耐藥性的機(jī)制。方法:1、通過RT-PCR、Western blot檢測(cè)30對(duì)乳腺癌組織及其配對(duì)癌旁組織中SALL4的表達(dá)差異;選取75例患者的乳腺癌組織,通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)乳腺癌中SALL4表達(dá)水平與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系。2、構(gòu)建沉默SALL4的乳腺癌細(xì)胞系,通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTT法、CCK-8法和裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SALL4對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖活性的影響;通過流式細(xì)胞儀及Western blot檢測(cè)SALL4對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡比例及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;通過流式細(xì)胞儀及Western blot檢測(cè)SALL4對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期及周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SALL4對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響;通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SALL4對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響;通過MTT法檢測(cè)SALL4對(duì)乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥性的影響。3、通過Western blot法檢測(cè)沉默SALL4基因后MCF-7細(xì)胞中PTEN、Notch1、Wnt3a的表達(dá)量,篩選SALL4可能調(diào)節(jié)的耐藥通路。構(gòu)建沉默SALL4的shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞株。阿霉素處理MCF-7,MCF-7/ADR,shSALL4-MCF-7/ADR后,MTT法檢測(cè)SALL4對(duì)細(xì)胞增殖活性及IC50的影響,流式細(xì)胞儀檢測(cè)SALL4對(duì)細(xì)胞凋亡情況及胞內(nèi)阿霉素含量的影響;RT-PCR和Western blot檢測(cè)SALL4對(duì)耐藥基因ABCB1、ABCG2、c-myc表達(dá)的影響;RT-PCR和Western blot檢測(cè)SALL4對(duì)PTEN表達(dá)的影響;Western blot檢測(cè)SALL4對(duì)p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR表達(dá)的影響。在阿霉素處理的MCF-7/ADR、shSALL4-MCF-7/ADR兩組細(xì)胞中,流式細(xì)胞儀檢測(cè)加入PTEN抑制劑后SALL4影響細(xì)胞凋亡比例的變化;Western blot檢測(cè)加入PTEN抑制劑后SALL4影響ABCB1、ABCG2、c-myc表達(dá)量的變化。結(jié)果:1、SALL4在乳腺癌組織中的表達(dá)量明顯高于與其配對(duì)的癌旁組織。在臨床病理資料統(tǒng)計(jì)中,SALL4高表達(dá)組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)明顯高于SALL4低表達(dá)組,而SALL4與年齡、病理類型、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、ER、PR、Her-2、Ki67表達(dá)水平無明顯相關(guān),其中SALL4陽性組腫瘤大小均值較陰性組有增加的趨勢(shì)。2、在MDA-MB-435、MDA-MB-468、MCF-7細(xì)胞系中成功構(gòu)建沉默SALL4的乳腺癌細(xì)胞系。沉默SALL4可以明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖活性,抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng);明顯降低乳腺癌細(xì)胞S期細(xì)胞比例,增加G1期細(xì)胞比例,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞停滯于G1期,阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展;沉默SALL4后乳腺癌細(xì)胞的凋亡比例明顯增加,侵襲和遷移能力明顯降低,對(duì)阿霉素的耐藥性明顯降低。3、成功構(gòu)建沉默SALL4的乳腺癌耐藥細(xì)胞系shSALL4-MCF-7/ADR,驗(yàn)證SALL4在MCF-7/ADR中的表達(dá)量明顯高于MCF-7、shSALL4-MCF-7/ADR。在阿霉素處理的細(xì)胞中沉默SALL4,各組細(xì)胞的IC50降低,凋亡率顯著上升,胞內(nèi)阿霉素含量顯著上升,ABCB1、ABCG2、c-myc表達(dá)量明顯下降。沉默SALL4后各組細(xì)胞PTEN表達(dá)量明顯上升,p-AKT、p-mTOR表達(dá)量明顯下降。shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞的凋亡比例較MCF-7/ADR細(xì)胞明顯上升,耐藥基因ABCB1、ABCG2、c-myc表達(dá)量明顯下降;加入PTEN抑制劑后shSALL4-MCF-7/ADR細(xì)胞的凋亡比例無明顯上升,ABCB1、ABCG2、c-myc表達(dá)量無明顯下降。結(jié)論:SALL4在乳腺癌組織中的表達(dá)量較癌旁組織高,與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān);沉默SALL4可以明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖活性,增加乳腺癌細(xì)胞的凋亡,阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展,抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移,降低乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性;SALL4在MCF-7細(xì)胞中可以通過PTEN/AKT/mTOR通路影響乳腺癌細(xì)胞的阿霉素耐藥性。本研究對(duì)深入了解乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了新的理論依據(jù),為乳腺癌的治療提供可能的新的治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.9
【圖文】：

圖 1 SALL4 在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)。A：Western blot 驗(yàn)證 SALL4 的表達(dá)；B：RT-PCR 驗(yàn)證 SALL4 mRNA 的表達(dá)。3.2 SALL4 表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性免疫組織化學(xué)(SP)法檢測(cè) SALL4 在乳腺癌組織中的表達(dá)。圖 2A 為 SALL4高表達(dá)的乳腺癌組織，圖 2B 為 SALL4 低表達(dá)的乳腺癌組織，并按照免疫組織化學(xué)染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)將其分為SALL4 高表達(dá)組(n=26)與SALL4 低表達(dá)組(n=49)(圖2)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn) SALL4 高表達(dá)組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)明顯高于 SALL4 低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；而與患者的年齡、病理類型、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、ER、PR、Her-2、Ki67 表達(dá)水平無明顯相關(guān)(p>0.05)。其中 SALL4 陽性組腫瘤大小均值(4.337±3.385cm)較 SALL4 陰性組腫瘤大小均值(3.919±2.690cm)大，

鄡浞治sALL4 高表達(dá)組(n=26)與SALL4 低表達(dá)組(n=49)(圖2)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn) SALL4 高表達(dá)組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)明顯高于 SALL4 低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；而與患者的年齡、病理類型、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、ER、PR、Her-2、Ki67 表達(dá)水平無明顯相關(guān)(p>0.05)。其中 SALL4 陽性組腫瘤大小均值(4.337±3.385cm)較 SALL4 陰性組腫瘤大小均值(3.919±2.690cm)大，

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本文編號(hào)：2729048