發(fā)布時間：2020-06-22 21:35

【摘要】：研究背景及目的:乳腺癌作為女性所罹患惡性腫瘤中最常見的病種之一,約占所有惡性腫瘤的30%。盡管包括手術、放療、化療和內分泌治療在內的綜合治療顯著降低了早期死亡率,但乳腺癌仍然是女性癌癥死亡最常見原因中的第二位。惡性腫瘤的發(fā)生是由多種致癌因素引起的,其特點是細胞增殖失控和遠處轉移。骨是晚期乳腺癌最常見的轉移部位,據報道發(fā)生率約為60-80%,骨轉移大大增加了病理性骨折和脊髓壓迫等并發(fā)癥,嚴重影響生活質量。鑒于晚期乳腺癌患者發(fā)生骨轉移的后續(xù)治療策略及療效較為有限。故探明乳腺癌骨轉移的分子生物學機制,尋求新的藥理學靶點,對患者的預后意義重大。微纖維相關蛋白5(Microfibrillar-associated protein 5,MFRP5)也稱為微纖維相關糖蛋白2(microfibril-associated glycoprotein 2,MAGP2),是細胞外彈性微纖維的一個組成部分,在骨骼生長、心血管發(fā)育、肺泡彈性發(fā)育和馬凡綜合征中發(fā)揮重要作用。研究表明,MFAP5由骨髓間充質基質細胞(Bone marrow mesenchymal stromal cell,BMSC)分泌,并在造血和免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用,而MFAP5的缺失可預防小鼠骨質疏松。這些結果表明MFAP5在骨微環(huán)境中的關鍵作用。最近的研究進一步表明,MFAP5在頭頸部惡性腫瘤、胰腺癌、肺癌和舌癌中過度表達,但是MFAP5在這些腫瘤中的作用仍有待闡明。已有研究表明,血清MFAP5水平與卵巢癌患者預后負相關,而癌細胞分泌的MFAP5能夠促進腫瘤增殖,內皮細胞遷移,腫瘤血管生成和化療藥物耐藥。然而,課題組成員經過文獻檢索,發(fā)現(xiàn)關于MFAP5在乳腺癌骨轉移中作用機制的文獻尚屬少數。由于MFAP5在惡性腫瘤和骨微環(huán)境中的重要作用,我們設計實驗,想進一步了解MFAP5在乳腺癌骨轉移中的作用。在本研究中,我們首先驗證了MFAP5在乳腺癌骨轉移灶中的高表達,并探究了MFAP5對乳腺癌腫瘤細胞增殖和遷移的影響,并進一步探討了可能的分子機制,特別是ERK/MMP信號通路。研究方法:我們的研究采用在海軍軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院收集的乳腺癌原發(fā)病灶、癌旁正常組織及骨轉移組織。首先,我們進行MFAP5的免疫組化染色,隨后通過western blot及q R-T PCR實驗,分別在蛋白水平和m RNA水平驗證MFAP5的表達。第二部分的實驗中,我們首先構建MFAP5過表達質粒,并通過PCR擴增的MFAP5的密碼序列插入pcDNA3.1+質粒中。一方面進行CCK8實驗:在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)兩珠乳腺癌細胞系MCF7和MDA-MB-231,細胞用DNA轉染試劑或si RNA轉染質粒。用過表達質�；騭i RNA轉染的MCF7和MDA-MB-231細胞以每孔5×103的起始密度接種在96孔板中,48h后使用細胞計數試劑盒進行計數,使用酶標儀在450nm處測量吸光度來測量結果。隨后,我們使用8-μm孔徑的transwell室進行transwell遷移試驗。消化并計數用過表達(OE)質�；騭i RNA轉染的MCF7和MDA-MB-231細胞。為進一步研究MFAP5調控乳腺癌骨轉移的分子機制,我們進行western blot實驗,研究MFAP5與MMP2,MMP9,p-FAK,FAK,p-Erk1/2,Erk1/2,p-c Jun(Ser63),p-c Jun(Ser73),c Jun之間表達的相互影響及關系。實驗中,均使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數據格式為平均值±標準差,數據比較使用獨立樣本t檢驗。所有實驗均重復3次,并納入代表性結果。p0.05被認為是有統(tǒng)計學意義的。結果:IHC顯示MFAP5主要在細胞間隙中表達,并且在骨轉移灶中的表達顯著高于原發(fā)灶。western blot檢測進一步證實MFAP5在骨轉移中的表達高于原發(fā)灶。此外,q RT-PCR檢測結果顯示,在乳腺癌骨轉移灶中MFAP5的m RNA水平顯著高于原發(fā)灶(p0.05)。MFAP5在MDA-MB-231細胞中MFAP5的表達水平最高,在MCF7細胞中最低。Western blot實驗證實了過表達質粒和si RNA分別對MFAP5的表達起到促進及抑制作用。MCF7和MDA-MB-231細胞中進行的CCK8實驗顯示,MFAP5過表達后細胞活力明顯增強,而抑制MFAP5后細胞增殖明顯下調,表明MFAP5介導乳腺癌的細胞增殖。Transwell實驗顯示,MFAP5過表達的細胞遷移能力明顯增強,而抑制MFAP5后,細胞遷移能力顯著降低。這些結果提示MFAP5可能通過增強細胞的遷移能力而促進乳腺癌的轉移。在MCF7和MDA-MB-231細胞中,MFAP5過表達時MMP2和MMP9的m RNA水平顯著增高,而MMP7和MMP14的m RNA水平幾乎不變。Western blot進一步表明,與OE-Ctrl質粒相比,轉染OE-MFAP5質粒的MMP2和MMP9的表達顯著上調,相反,si RNA對MFAP5的抑制則明顯抑制了MMP2和MMP9的表達。這些結果表明MFAP5可能通過調節(jié)MMP2和MMP9的表達在乳腺癌骨轉移中發(fā)揮作用。MFAP5的過表達對FAK,Erk1/2和c Jun的表達無明顯影響,但MFAP5明顯激活了FAK,Erk1/2和c Jun的磷酸化。相反,通過si RNAs抑制MFAP5的表達則明顯抑制了p-FAK,p-Erk1/2和p-c Jun的表達。這些結果提示MFAP5可能通過ERK信號通路調控MMP2和MMP9的表達。結論:通過本研究,我們首先報道了乳腺癌骨轉移灶中MFAP5表達水平相比原發(fā)灶的明顯上調,并進一步發(fā)現(xiàn)MFAP5過表達加速了乳腺癌細胞的增殖和遷移,而當MFAP5被抑制時則呈現(xiàn)相反的效果。此外,MFAP5能夠能激活ERK信號通路,增加MMP2和MMP9的表達,相反,抑制MFAP5的表達后,MMP2、MMP9、p-FAK、p-Erk1/2和p-c Jun的表達也受到抑制。這些結果表明MFAP5作為癌基因在乳腺癌骨轉移中發(fā)揮作用,希望通過我們的研究能夠找到乳腺癌骨轉移新的診斷和治療方法。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

測MFAP5分別在乳腺癌骨轉移灶、乳腺癌原發(fā)灶及瘤旁組織中的表達。 結果顯示，MFAP5主要在細胞間隙中表達，并且在骨轉移灶中與乳腺癌原發(fā)灶及瘤旁組織相比顯著上調（圖1-1）。western blot檢測進一步證實MFAP5在骨轉移中的表達高于乳腺癌原發(fā)灶及瘤旁組織（圖1-2）。我們進一步提取三種組織的總RNA，qRT-PCR檢測RNA逆轉錄的cDNA，根據結果，在乳腺癌骨轉移灶中MFAP5的mRNA水平顯著高于原發(fā)灶及瘤旁組織（p <0.05）（圖1-3）。圖 1-1：IHC 染色檢測 MFAP5 在乳腺癌瘤旁組織、原發(fā)灶及骨轉移灶中的表達圖 1-2：western blot 檢測 MFAP5 在乳腺癌瘤旁組織、原發(fā)灶及骨轉移灶中的表達

MFAP5主要在細胞間隙中表達，并且在骨轉移灶中與乳腺癌原發(fā)灶及瘤旁組織相比顯著上調（圖1-1）。western blot檢測進一步證實MFAP5在骨轉移中的表達高于乳腺癌原發(fā)灶及瘤旁組織（圖1-2）。我們進一步提取三種組織的總RNA，qRT-PCR檢測RNA逆轉錄的cDNA，根據結果，在乳腺癌骨轉移灶中MFAP5的mRNA水平顯著高于原發(fā)灶及瘤旁組織（p <0.05）（圖1-3）。圖 1-1：IHC 染色檢測 MFAP5 在乳腺癌瘤旁組織、原發(fā)灶及骨轉移灶中的表達圖 1-2：western blot 檢測 MFAP5 在乳腺癌瘤旁組織、原發(fā)灶及骨轉移灶中的表達

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本文編號：2726276