【摘要】：糖與核酸、脂類和蛋白質一樣,都是組成細胞的重要成分。它不僅是細胞能量的主要來源,更在生命活動的調控方面起著非常關鍵的作用。研究發(fā)現,糖基化的異常修飾與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。糖基化的修飾主要通過糖基轉移酶的催化完成。糖基轉移酶的異常表達在調節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著十分重要的角色,并能夠作為生物標記物為腫瘤的干預治療提供特異性靶點。唾液酸是一種帶有負電荷的九碳單糖,常位于糖鏈末段,能夠與細胞膜表面蛋白等結合,是傳遞生物學信息的重要分子。唾液�；D移酶是一類糖基轉移酶,它能夠將唾液酸以α2,3-或α2,6-兩種方式連接在Gal或Gal NAc上,或以α2,8-的連接方式結合在蛋白質上。根據轉移唾液�；笏鶚嫵傻牟煌愋偷奶擒真I可將唾液�；D移酶分為ST3Gal I-VI,ST6Gal I-II,ST6Gal NAc I-VI以及ST8Sia I-VI四類。目前發(fā)現許多腫瘤抗原中均存在唾液酸化修飾,而這其中主要的唾液酸化抗原是SLe A和SLe X,經證實它們在多種惡性腫瘤中均有不同程度的高表達,并與腫瘤預后不良有關。膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤,在世界范圍內都具有較高的發(fā)病率和死亡率,對其早期診斷和個性化治療是治療取得成功的關鍵,因此尋找一個有效的診斷及治療靶點仍是當下研究的熱點。然而目前,關于唾液酸化修飾在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制研究尚少。一、目的1.揭示α2,3-唾液�；D移酶在膀胱尿路上皮癌與正常膀胱尿路上皮中表達量的差異及其對膀胱癌病人生存率的影響;2.揭示α2,3-唾液酰基轉移酶對膀胱癌細胞生長、增殖、遷移和侵襲等細胞生物學行為的影響;3.闡明α2,3-唾液�；D移酶介導膀胱癌細胞惡性生物學行為的分子機制。二、方法1.利用基因芯片對收集的臨床樣本進行全基因組表達譜分析;Real-time PCR,免疫組化,Western-blot等方法檢測膀胱癌組織與正常膀胱尿路上皮中糖基轉移酶的分布及表達差異;Kaplan-Meier統(tǒng)計學方法分析α2,3-唾液�；D移酶對膀胱癌患者生存率的影響。2.利用Real-time PCR分析檢測唾液酰基轉移酶前家族成員在不同膀胱癌細胞系的表達水平;Western-blot檢測ST3Gal4和ST3Gal6在不同膀胱癌細胞系與正常膀胱尿路上皮細胞之間的表達差異;通過脂質體轉染、G418和有限稀釋法構建篩選出穩(wěn)定過表達ST3Gal4和ST3Gal6的5637和T24單克隆細胞株;Real-time PCR、Western-blot、流式細胞術及免疫熒光化學鑒定ST3Gal4和ST3Gal6在5637和T24細胞中的表達情況。3.利用CCK8、平板克隆、流式細胞術周期、劃痕實驗和transwell遷移侵襲等實驗及檢測α2,3-唾液�；D移酶對膀胱癌細胞生長、增殖、遷移及侵襲能力的影響;裸鼠體內成瘤實驗檢測過表達ST3Gal4和ST3Gal6后膀胱癌細胞在體內成瘤能力的變化。4.通過Western blot研究α2,3-唾液�；D移酶影響膀胱癌細胞惡性表型的分子機制并通過免疫組化染色檢測相關分子的表達與定位。三、結果1.有多種糖基轉移酶在膀胱癌組織中的表達水平具有差異,其中ST3Gal4和ST3Gal6表達差異顯著,兩者在膀胱癌組織中的表達量與正常膀胱尿路上皮相比均有不同程度下調,且其在膀胱癌組織中表達下調與患者預后生存率低相關;2.通過Western blot、免疫熒光、流式細胞術及Real-time PCR鑒定,已經成功構建穩(wěn)定過表達ST3Gal4和ST3Gal6的膀胱癌細胞系。3.分別過表達ST3Gal4和ST3Gal6,均可抑制膀胱癌細胞在體外的生長、增殖、遷移及侵襲能力;體內實驗顯示:兩者過表達后小鼠成瘤能力下降,腫瘤體積變小。4.ST3Gal4和ST3Gal6過表達可抑制MMP2、MMP9、AKT、P-S6K、m TOR及EIF4B等蛋白的表達水平。四、結論1.ST3Gal4和ST3Gal6在膀胱癌組織中表達量較正常膀胱尿路上皮中減少,其表達下調與患者腫瘤病理分級密切相關,低表達提示膀胱癌患者低生存率。2.ST3Gal4和ST3Gal6介導的α2,3-唾液酸化修飾增加能夠抑制膀胱癌細胞在體內及體外的生長、增殖、遷移及侵襲能力。3.α2,3-唾液�；D移酶對膀胱癌惡性行為的影響主要通過PI3K-AKT信號通路發(fā)揮作用。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.14
【圖文】：

大連醫(yī)科大學碩士學位論文3. 檢測 ST3Gal4 及 ST3Gal6 在膀胱癌組織中蛋白水平的表達情況為了探究 ST3Gal4 及 ST3Gal6 與膀胱癌病理特征之間的關系及其對膀胱癌發(fā)生發(fā)展的影響，我們通過免疫組化染色的方法在 107 例膀胱癌臨床樣本檢測ST3Gal4 及 ST3Gal6 在不同病理分級的臨床樣本組織中的表達水平，同時通過Western blot 的方法檢測 9 例膀胱癌組織樣本中 ST3Gal4 及 ST3Gal6 中蛋白水平的表達情況。如圖 1-3（A）所示，與正常膀胱尿路上皮組織相比，隨著膀胱癌惡性程度的增加，ST3Gal4 及 ST3Gal6 蛋白的表達量呈下降趨勢。如圖 1-3（B）所示，通過對 9 例樣本的組織進行 Western blot 檢測，發(fā)現 ST3Gal4 及 ST3Gal6蛋白的表達量較正常膀胱尿路上皮組織減少，與 RNA 水平的檢測結果一致，這一結果我們還需要進一步擴大樣本量重復驗證。

Fig.2-3-1 Identification of recombinant expression vector pcDNA3.1(-)/ST3Gal4.圖 2-3-1 重組表達載體 pcDNA3.1（-）/ ST3Gal4 的鑒定。-3-2 所示，利用 EcoRI/Hind III 雙酶切和 DNA 測序鑒定 ST3G性克隆，測序反應由南京巴傲得生物科技有限公司提供并完成結果完全相符。

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本文編號：2712676