【摘要】：結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率逐年升高,已經(jīng)成為了世界范圍內(nèi)腫瘤相關死亡的主要原因之一。在我國,隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展,居民生活方式的轉變,以及人口老齡化的加劇,CRC的發(fā)病和死亡均呈明顯上升的趨勢,且發(fā)病年齡有年輕化的趨勢。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是臨床上最常用的治療轉移性結直腸癌((metastatic colorectal cancer,mCRC)的化療藥物之一,但是,固有或獲得性耐藥等因素阻礙了其充分發(fā)揮抗腫瘤作用,mCRC患者的預后仍然較差,5年生存率不到10%。因此,尋找有效的CRC治療策略具有重要的意義。聯(lián)合用藥是克服耐藥的有效方法,而對聯(lián)合作用的具體分子機制的深入理解是開發(fā)更好的聯(lián)合療法的關鍵所在。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)能夠誘導多種惡性腫瘤細胞和轉化細胞凋亡,對正常組織和細胞無明顯毒性。有研究表明,細胞毒性藥物、放射線、分子靶向藥物等與TRAIL聯(lián)用能增強其誘導多種惡性腫瘤細胞凋亡的作用,并且能逆轉惡性腫瘤細胞對TRAIL的耐藥性。環(huán)化變構TRAIL(circular permuted TRAIL,CPT)或稱為重組變構人TRAIL(recombinant mutant human TRAIL,rmh TRAIL)是由野生型TRAIL結構優(yōu)化而產(chǎn)生,其穩(wěn)定性、溶解性、抗腫瘤活性和安全性均優(yōu)于野生型TRAIL,研究顯示CPT對多種非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)細胞具有顯著的抑制作用,而對人正常細胞則無毒性;CPT與順鉑(cisplatin,DDP)聯(lián)合應用對NSCLC細胞系的生長抑制作用明顯加強或表現(xiàn)為協(xié)同作用,而對正常人細胞不表現(xiàn)明顯的毒性,體內(nèi)試驗也得出了類似的結果。此外,多項研究已證明,CPT已經(jīng)成為一種有潛力的治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物。以上均顯示出CPT具有良好的抗腫瘤治療前景。然而,迄今為止,有關CPT在結直腸癌中的研究尚未見報道。在本研究中,我們首次觀察了CPT單藥及CPT與5-FU聯(lián)用對人CRC細胞增殖及凋亡的作用,并對誘導凋亡的相關分子機制進行了探討;通過建立CRC細胞HCT116荷瘤裸鼠模型,觀察了CPT與5-FU聯(lián)用對裸鼠成瘤能力的影響,并應用TUNEL/DAPI染色法檢測了CPT與5-FU聯(lián)用對CRC移植瘤細胞凋亡的影響。本研究的主要目的在于明確:(1)CPT單藥是否能夠抑制CRC細胞的增殖并誘導CRC細胞凋亡;(2)CPT與5-FU聯(lián)用能否增強抗腫瘤效果;5-FU能否增加CRC細胞對CPT的敏感性;(3)CPT與5-FU聯(lián)合抗腫瘤作用的分子機制;(4)CPT與5-FU聯(lián)用的體內(nèi)抗腫瘤效果如何。研究結果將為今后開展CPT治療CRC的臨床試驗提供實驗依據(jù),為將來臨床上應用此聯(lián)合方案治療晚期CRC作為新的治療方式奠定基礎。本研究分以下三部分:第一部分環(huán)化變構TRAIL聯(lián)合5-FU抑制人結直腸癌細胞增殖及誘導其凋亡的作用目的:觀察CPT和/或5-FU對人CRC細胞HCT116和SW480體外增殖及凋亡的影響。方法:1.細胞增殖抑制實驗將CRC細胞HCT116和SW480分別接種于96孔板,每株細胞分為不同濃度的5-FU組和不同濃度的CPT組,待24h細胞過夜貼壁后,分別用不同濃度的5-FU處理48h,用不同濃度的CPT處理12、24或48h。然后加入MTS,繼續(xù)培養(yǎng)3h,用酶標儀檢測各孔吸光度值(OD值),根據(jù)公式計算出各時間點的細胞增殖抑制率,進一步得到半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50),IC50為細胞生長抑制達50%時的藥物濃度。CPT與5-FU聯(lián)用對CRC細胞的增殖抑制作用:將CRC細胞HCT116和SW480分別接種于96孔板,待24h細胞貼壁后,HCT116細胞用5μg/mL的5-FU聯(lián)合不同濃度的CPT共同作用48h;SW480細胞用12.5μg/mL的5-FU聯(lián)合不同濃度的CPT共同作用48h,然后加入MTS繼續(xù)培養(yǎng)3h,用酶標儀檢測各孔OD值,根據(jù)公式計算出兩株CRC細胞的增殖抑制率。2.流式細胞術檢測兩株CRC細胞的凋亡率將CRC細胞HCT116和SW480以5×10~5個/孔的密度分別接種于6孔板,每株細胞分為六組:對照組、5-FU組、CPT低濃度組、CPT高濃度組、5-FU+CPT低濃度組和5-FU+CPT高濃度組,細胞過夜貼壁后分別加入CPT和/或5-FU處理24h或48h,收集細胞,用Annexin V-FITC和PI雙染細胞,室溫下避光反應5分鐘,用流式細胞術檢測細胞凋亡率。結果:1.CPT或5-FU單藥對兩株CRC細胞均有明顯的增殖抑制作用MTS結果顯示:不同濃度的5-FU單藥分別作用于CRC細胞HCT116和SW480 48h,能明顯抑制兩株細胞的增殖,細胞的增殖抑制率隨5-FU濃度的增大而增加,呈濃度依賴效應(P0.001)。不同濃度的CPT單藥分別作用于CRC細胞HCT116和SW480 12、24或48h,MTS結果顯示:CPT單藥對CRC細胞HCT116和SW480具有明顯的增殖抑制作用,隨著CPT濃度的增大,細胞的增殖抑制率逐漸增加,隨著作用時間的延長,細胞的增殖抑制率也增加,呈時間和濃度依賴效應(P0.001)。在48h,CPT對CRC細胞HCT116和SW480的IC50值分別為8.49 ng/mL和338.43 ng/mL。2.CPT與5-FU聯(lián)用對兩株CRC細胞的增殖抑制作用明顯增強CPT與5-FU聯(lián)合作用于CRC細胞HCT116和SW480 48h,結果顯示,聯(lián)合用藥組的細胞增殖抑制率明顯高于單藥CPT或5-FU組,差異均有顯著性(P0.001)。3.5-FU能增強CPT誘導CRC細胞凋亡的作用流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示,無論5-FU還是CPT單藥均能誘導CRC細胞HCT116和SW480凋亡;當CPT與5-FU聯(lián)用時,兩株細胞的凋亡率均明顯高于單藥組,差異均有顯著性(P0.05)。兩株細胞在CPT高濃度組的凋亡率高于低濃度組,差異均有顯著性(P0.05)。各藥物處理組細胞在48h的凋亡率均高于24h的凋亡率,差異均有顯著性(P0.05)。小結:1.CPT單藥能抑制CRC細胞HCT116和SW480增殖,且增殖抑制作用呈時間和濃度依賴效應;5-FU單藥對CRC細胞HCT116和SW480具有明顯的增殖抑制作用,呈濃度依賴效應;2.CPT與5-FU聯(lián)用對CRC細胞HCT116和SW480的增殖抑制作用顯著增強;3.CPT單藥能誘導CRC細胞HCT116和SW480發(fā)生凋亡;CPT與5-FU聯(lián)用誘導CRC細胞HCT116和SW480凋亡的作用明顯增強。第二部分環(huán)化變構TRAIL聯(lián)合5-FU誘導人結直腸癌細胞凋亡機制探討目的:探討CPT聯(lián)合5-FU誘導人CRC細胞凋亡的作用機制。方法:1.Western blot法檢測CPT聯(lián)合5-FU對CRC細胞凋亡信號通路中相關蛋白表達的影響將CRC細胞HCT116和SW480分別以5×10~5個/孔的密度接種于6孔板中,每株細胞分四組:對照組、5-FU組、CPT組、5-FU+CPT組,細胞過夜貼壁后分別加入5-FU和/或CPT處理48h,然后裂解細胞收集蛋白,行蛋白定量,用10%SDS-PAGE分離蛋白、轉膜、5%脫脂奶粉封閉、一抗4℃過夜孵育、二抗常溫孵育1.5h,用ECL試劑進行顯色,采用化學發(fā)光成像系統(tǒng)分析相關蛋白的表達情況。2.流式細胞術檢測廣譜caspase抑制劑z-VAD-FMK對CPT或CPT聯(lián)合5-FU誘導CRC細胞凋亡的影響應用廣譜caspase抑制劑z-VAD-FMK分別處理CRC細胞HCT116和SW480 1h后,各實驗組加入CPT或CPT聯(lián)合5-FU繼續(xù)作用48h,收集細胞,用Annexin V-FITC和PI雙染細胞,室溫下避光反應5min,用流式細胞術檢測細胞凋亡率。3.Western blot法檢測廣譜caspase抑制劑z-VAD-FMK對CPT或CPT聯(lián)合-5FU誘導的CRC細胞凋亡信號通路中相關蛋白表達的影響應用廣譜caspase抑制劑z-VAD-FMK分別處理CRC細胞HCT116和SW480 1h后,各實驗組加入CPT或CPT聯(lián)合5-FU繼續(xù)作用48h,然后裂解細胞收集蛋白,行蛋白定量,用10%SDS-PAGE分離蛋白、轉膜、5%脫脂奶粉封閉、一抗4℃過夜孵育、二抗常溫孵育1.5h,用ECL試劑進行顯色,采用化學發(fā)光成像系統(tǒng)分析相關蛋白的表達情況。結果:1.CPT與5-FU聯(lián)用對凋亡信號通路中相關蛋白表達的影響1.1 CPT與5-FU聯(lián)用能誘導CRC細胞發(fā)生caspase依賴性的凋亡Western blot結果顯示,CPT單藥能導致兩株CRC細胞中caspase-3、caspase-8和PARP的表達水平下降,而使cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和PARP的裂解片段表達水平升高;與CPT單藥組相比,聯(lián)合用藥組兩株細胞中cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和PARP的裂解片段表達水平明顯升高。另外,CPT與5-FU聯(lián)用能導致兩株CRC細胞中caspase-9的表達水平下降,但沒有檢測到裂解形式的caspase-9的表達。1.2 5-FU作用于CRC細胞能引起死亡受體(DRs)的表達上調(diào)不同濃度的5-FU分別作用于CRC細胞HCT116和SW480 48h,應用Western blot法檢測死亡受體4(DR4)和DR5的表達情況,結果顯示:5-FU能明顯上調(diào)HCT116細胞中DR4和DR5的表達,而在SW480細胞,5-FU只能引起DR4的表達上調(diào),與對照組相比差異均有顯著性(P0.001)。1.3 CPT與5-FU聯(lián)用能下調(diào)CRC細胞Bcl-XL的表達水平CPT和/或5-FU作用于CRC細胞HCT116和SW480 48h后,用Western blot法檢測BAX、Bcl-XL和XIAP蛋白的表達情況,結果顯示:CPT與5-FU聯(lián)用使Bcl-XL的表達水平下降,而對BAX和XIAP的表達水平無明顯影響。2.廣譜caspase抑制劑z-VAD-FMK能抑制CPT或CPT聯(lián)合5-FU誘導的CRC細胞凋亡流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示:廣譜caspase抑制劑z-VAD-FMK能明顯抑制CPT或CPT聯(lián)合5-FU誘導的兩株CRC細胞凋亡。HCT116細胞加或不加z-VAD-FMK處理,CPT組的凋亡率分別為16.3±0.4%和59.9±0.9%,CPT聯(lián)合5-FU組的凋亡率分別為33.6±2.4%和90.8±0.8%,差異均有顯著性(P0.001);SW480細胞加或不加z-VAD-FMK處理,CPT組的凋亡率分別為18.9±0.5%和43.7±0.2%,CPT聯(lián)合5-FU組的凋亡率分別為29.7±0.2%和69.6±0.9%,差異均有顯著性(P0.001)。3.廣譜caspase抑制劑z-VAD-FMK能夠阻斷CRC細胞中凋亡信號的傳導Western blot結果顯示:CPT單藥或CPT與5-FU聯(lián)用能明顯上調(diào)cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和PARP蛋白的裂解片段在CRC細胞HCT116和SW480中的表達,當加入z-VAD-FMK后,這種裂解作用明顯受到抑制。結果表明,CPT或CPT聯(lián)合5-FU誘導CRC細胞凋亡是caspase依賴性的。小結:1.CPT及CPT與5-FU聯(lián)用誘導CRC細胞凋亡是caspase依賴性的;2.5-FU通過上調(diào)DRs的表達及下調(diào)Bcl-XL的表達來增強CPT誘導CRC細胞凋亡的作用及增加CRC細胞對CPT的敏感性;3.廣譜caspase抑制劑z-VAD-FMK能顯著抑制CPT單藥或CPT與5-FU聯(lián)用誘導的CRC細胞凋亡;4.廣譜caspase抑制劑z-VAD-FMK能使cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和PARP蛋白的裂解片段表達水平明顯下降,有效阻斷了caspase介導的細胞信號轉導;5.Caspase家族蛋白酶在CPT及CPT聯(lián)合5-FU誘導CRC細胞凋亡中起了關鍵作用。第三部分環(huán)化變構TRAIL聯(lián)合5-FU體內(nèi)抗腫瘤作用目的:建立人CRC荷瘤裸鼠模型,觀察CPT與5-FU聯(lián)用在體內(nèi)的抗腫瘤效果。方法:1.建立CRC細胞HCT116荷瘤裸鼠模型取處于對數(shù)生長期的CRC細胞HCT116,調(diào)整細胞濃度為5×10~7個/mL,接種于6周齡雌性BALB/C裸鼠右側腋窩中部皮下,每只裸鼠接種6×10~6個細胞。待腫瘤生長至100-120mm~3時,隨機分為5組,每組5只裸鼠,并給藥處理,自用藥當天開始,每5天測量裸鼠體重、并測量瘤徑,按公式計算腫瘤體積,瘤體積=1/2×長徑×短徑~2。第25天,處死裸鼠,剝?nèi)×鼋M織稱重并拍照。每只裸鼠的腫瘤組織分為兩份,一份保存于液氮,另一份用30%蔗糖溶液浸泡后制成冰凍切片。2.TUNEL/DAPI法檢測裸鼠移植瘤細胞的凋亡情況用冰凍切片機連續(xù)切片,每片3μm,然后進行TUNEL/DAPI染色,最后利用激光共聚焦顯微鏡觀察裸鼠移植瘤的細胞凋亡情況,并拍照。結果:1.CPT聯(lián)合5-FU對荷瘤裸鼠生長狀態(tài)的影響實驗過程中,荷瘤裸鼠精神狀態(tài)良好,生長狀態(tài)良好,飲食及活動正常;裸鼠腫瘤表面皮膚無潰爛,各組動物均無死亡,各組裸鼠體重間無明顯的差別(P0.05)。表明CPT和5-FU無論單獨用藥還是兩者聯(lián)合對荷瘤裸鼠均未引起明顯的不良反應,耐受良好。2.CPT聯(lián)合5-FU對人CRC荷瘤裸鼠皮下移植瘤的生長抑制作用CPT和5-FU單藥均能抑制裸鼠移植瘤的生長,與對照組比較差異均有顯著性(P0.001),而兩藥聯(lián)合對裸鼠移植瘤的生長抑制作用更加顯著,并且以高濃度的CPT(7.5mg/kg)與5-FU聯(lián)合組最為顯著,與其它組比較差異有顯著性(P0.001),且兩聯(lián)合組之間差異也有顯著性(P0.01)。3.CPT聯(lián)合5-FU促進了荷瘤裸鼠移植瘤細胞的凋亡TUNEL/DAPI染色法檢測移植瘤細胞凋亡結果顯示:CPT、5-FU及CPT聯(lián)合5-FU均能導致裸鼠移植瘤細胞發(fā)生凋亡,但聯(lián)合組誘導凋亡的作用顯著強于單藥組(P0.001),并且高濃度的CPT與5-FU聯(lián)合誘導凋亡的作用最為顯著。小結:1.CPT與5-FU聯(lián)用對CRC細胞HCT116荷瘤裸鼠的腫瘤具有顯著的生長抑制作用,并且高濃度CPT與5-FU聯(lián)用抑制腫瘤生長的作用更強;荷瘤裸鼠對該用藥方案耐受性良好,無明顯不良反應發(fā)生;2.CPT與5-FU聯(lián)用對CRC細胞HCT116荷瘤裸鼠的腫瘤細胞有促進凋亡的作用。結論:1.CPT單藥在體外能抑制CRC細胞增殖并誘導其凋亡;CPT與5-FU聯(lián)用能增強對CRC細胞增殖抑制及誘導凋亡的作用;2.CPT及CPT與5-FU聯(lián)用誘導CRC細胞凋亡是caspase依賴性的;3.5-FU通過上調(diào)DRs的表達及下調(diào)Bcl-XL的表達來增強CPT誘導CRC細胞凋亡的作用及增加CRC細胞對CPT的敏感性;4.CPT單藥能抑制CRC荷瘤裸鼠移植瘤的生長,CPT與5-FU聯(lián)用對裸鼠移植瘤的生長抑制作用明顯增強;CPT與5-FU聯(lián)用促進了CRC荷瘤裸鼠腫瘤細胞的凋亡。
【圖文】：

32同濃度 5-FU 對 CRC 細胞 HCT116 和 SW480 的增lorectal cancer cell lines HCT116 and SW480 were tre concentrations of 5-FU for 48 h, after which the MTSperformed to evaluate cell proliferation inhibition rate

33同濃度 CPT 對 CRC 細胞 HCT116 和 SW480 的增T116 and SW480 cells were treated with various doed for 12, 24, or 48 h. Then, the MTS assay was perfhe cell proliferation inhibition rate.△P<0.001 versufor 12 h;#P<0.001 versus cells treated for 12 or 24 h
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.34

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 陳萬青;孫可欣;鄭榮壽;張思維;曾紅梅;鄒小農(nóng);赫捷;;2014年中國分地區(qū)惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J];中國腫瘤;2018年01期

2 Torhild Veen;Kjetil S?reide;;Can molecular biomarkers replace a clinical risk score for resectable colorectal liver metastasis?[J];World Journal of Gastrointestinal Oncology;2017年03期

3 邵仟仟;林國樂;;2017.V1版《NCCN結直腸癌診治指南》更新解讀[J];中國全科醫(yī)學;2017年06期

4 吳一龍;;精準癌醫(yī)學:走向未來的路[J];循證醫(yī)學;2015年01期

5 Li Tao;Jin-Kun Yang;Ying Gu;Xin Zhou;Ai-Guang Zhao;Jian Zheng;Ying-Jie Zhu;;Weichang'an and 5-fluorouracil suppresses colorectal cancer in a mouse model[J];World Journal of Gastroenterology;2015年04期

6 Jeroen LA van Vugt;Kostan W Reisinger;Joep PM Derikx;Djamila Boerma;Jan HMB Stoot;;Improving the outcomes in oncological colorectal surgery[J];World Journal of Gastroenterology;2014年35期

7 陳瓊;劉志才;程蘭平;宋國慧;孫喜斌;鄭榮壽;張思維;陳萬青;;2003～2007年中國結直腸癌發(fā)病與死亡分析[J];中國腫瘤;2012年03期

8 王雅茹;溫樹鵬;王福旭;溫麗;楊渤彥;楊敬慈;張學軍;楊世方;;重組變構人TNF相關促凋亡配體聯(lián)合三氧化二砷誘導白血病耐藥細胞株凋亡[J];中國實驗血液學雜志;2008年05期

9 ;Predictive value of MTT assay as an in vitro chemosensitivity testing for gastric cancer:One institution's experience[J];World Journal of Gastroenterology;2008年19期

10 張學軍;溫麗;王福旭;羅建民;潘];劉小軍;杜行嚴;董作仁;楊世芳;;重組變構人TRAIL聯(lián)合柔紅霉素對白血病細胞誘導凋亡作用及其機制的研究[J];中國實驗血液學雜志;2006年06期

，

本文編號：2710755