【摘要】：研究背景:膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,在泌尿系統(tǒng)腫瘤中占據(jù)導致男性死亡的第二位,手術切除腫瘤后2年內(nèi),大部分患者會發(fā)生復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移。目前針對膀胱癌的診療手段效果有限,復發(fā)轉(zhuǎn)移仍然是嚴重影響膀胱癌患者預后及生活質(zhì)量的主要原因。腫瘤干細胞研究的結果顯示其可以解釋為何在重重防護措施之下,腫瘤仍然能進展、復發(fā)、轉(zhuǎn)移及出現(xiàn)獲得性耐藥。膀胱癌干細胞的靶向治療能夠為膀胱癌患者提供一種新的治療思路,很有可能成為治愈膀胱癌的關鍵。B7-H3是新發(fā)現(xiàn)的一種T細胞輔助刺激因子,其在腫瘤免疫過程中發(fā)揮的作用尚存在爭論,但其作為一種新的腫瘤相關抗原已被證實在多種上皮惡性腫瘤中異常表達,如前列腺癌、非小細胞肺癌、胃癌、卵巢癌等,且已有研究證實B7-H3參與調(diào)控腫瘤生物學功能,與腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移相關。本課題擬對比膀胱癌患者腫瘤病灶B7-H3表達量與復發(fā)轉(zhuǎn)移之間的關系,進一步在細胞和動物水平,應用分子生物學方法研究B7-H3是否能通過調(diào)控膀胱癌干細胞功能影響膀胱癌的復發(fā)以及轉(zhuǎn)移,為膀胱癌干細胞治療探尋潛在靶點。研究目的:研究B7-H3與膀胱癌患者復發(fā)轉(zhuǎn)移的關系及其對膀胱癌干細胞的影響。研究方法:1.收集156例膀胱癌患者腫瘤組織,包括72例在2年內(nèi)出現(xiàn)復發(fā)轉(zhuǎn)移、并行二次手術的膀胱癌患者(首次手術標本和二次手術標本),一半制成蠟塊,一半抽提組織液。運用免疫組化(Immunohistochemistry)和酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測B7-H3在復發(fā)的膀胱癌患者與未復發(fā)的膀胱癌患者中的表達情況。2.通過免疫磁珠分選的方法利用CD44和CD20抗體標記分選得到膀胱癌細胞株T24,BIU-87和5637干細胞富集群CD20-CD44+細胞群,RT-PCR驗證干細胞標志物CD44,CD20,CD133,Oct4和Bmi-1的表達,裸鼠成瘤實驗通過連續(xù)稀釋法驗證干細胞的強大的致瘤能力,收集三對三干細胞與非干細胞進行基因測序,RT-PCR驗證檢測結果。3.運用B7-H3沉默慢病毒和陰參懸浮轉(zhuǎn)染人膀胱癌細胞T24干細胞側(cè)群,經(jīng)過嘌呤霉素篩選得到B7-H3穩(wěn)定沉默的T24 CD20-CD44+細胞(B7-H3 KD CSCs)和對照組T24 CD20-CD44+細胞(NC CSCs)。m RNA水平(RT-PCR),蛋白水平(Western Blot)和細胞熒光(Cell fluorescence)三者協(xié)同驗證慢病毒懸浮轉(zhuǎn)染效率。懸浮培養(yǎng)行腫瘤微球體形成實驗及裸鼠荷瘤實驗,觀察B7-H3對膀胱癌干細胞自我更新、致瘤性和侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響。4.收集荷瘤小鼠腫瘤組織提取原代細胞,進行細胞功能試驗,研究B7-H3沉默干細胞所形成的腫瘤細胞的生物學特性是否與干細胞特性改變一致。結果:1.B7-H3在膀胱癌復發(fā)組陽性率達79.2%,顯著高于未復發(fā)組的53.6%,P0.05。且ELISA結果顯示行二次手術的復發(fā)腫瘤灶的表達量(158.26±8.13 ng/ml)明顯高于首次手術標本(67.45±5.68 ng/ml),P0.05。在膀胱癌復發(fā)患者二次手術腫瘤組織中,B7-H3與干細胞標志物CD44存在共表達關系,P0.05。2.免疫磁珠分選得到的CD20-CD44+細胞群證實為膀胱癌細胞系干細胞富集群,具有自我更新和強大的成瘤性�；蛐酒Y果和RT-PCR驗證結果共同顯示在三組膀胱癌干細胞系中,B7-H3在干細胞側(cè)群中顯著高表達,P0.05。3.RT-PCR,WB和細胞熒光共同驗證慢病毒轉(zhuǎn)染效率,B7-H3 KD CSCs細胞B7-H3表達穩(wěn)定降低約4倍,差異具有統(tǒng)計學意義,P0.05。懸浮培養(yǎng)14-21天,膀胱癌干細胞的自我更新能力在B7-H3 KD組明顯減弱,NC組腫瘤微球體在腫瘤球數(shù)量、直徑及生長速率方面均領先沉默組,P0.05。同時,對比NC組,B7-H3 KD組干細胞標志物表達下調(diào),P0.05。在體實驗結果顯示:和對照組相比,B7-H3沉默時,干細胞形成的腫瘤灶相對較小,生長能力較弱,肝臟出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移的病灶數(shù)量較少,肺臟甚至肉眼未觀察到轉(zhuǎn)移灶,差異具有統(tǒng)計學意義。4.從裸鼠移植瘤抽提原代細胞,Transwell實驗結果顯示B7-H3 KD組原代腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯弱于NC組原代細胞,P0.05;加入THP化療藥物處理24小時,流式結果顯示NC組原代細胞表現(xiàn)出更強的藥物耐受能力,B7-H3 KD組原代細胞凋亡增多,對藥物敏感性較好。結論:B7-H3與臨床膀胱癌患者復發(fā)及預后密切相關,B7-H3在膀胱癌干細胞中高表達,顯著加強干細胞的自我更新能力,調(diào)控腫瘤惡性生物行為,促進膀胱癌的侵襲轉(zhuǎn)移,可能通過調(diào)控干細胞功能參與膀胱癌復發(fā)和進展。靶向干預B7-H3可以作為膀胱癌干細胞治療新的方向,為臨床早期診斷膀胱癌復發(fā)高危風險及指導預后治療提供新策略。
【圖文】：

圖 1. 免疫組化檢測復發(fā)膀胱癌中 B7-H3 表達，左圖為低表達，右圖為高表達。圖 2. 免疫組化檢測復發(fā)膀胱癌中 CD44 表達，左圖為低表達，右圖為高表達。討 論膀胱癌是全世界威脅男性健康最主要的惡性腫瘤之一，在我國也是位居男性最常見泌尿系統(tǒng)腫瘤的前列，其發(fā)病率和死亡率逐年上升，由于其具有易復發(fā)性，膀胱癌患者的治療周期較長，患者承受的經(jīng)濟壓力和心理壓力均較大，給患者個人、家庭和

圖 2. 免疫組化檢測復發(fā)膀胱癌中 CD44 表達，左圖為低表達，右圖為高表達討 論膀胱癌是全世界威脅男性健康最主要的惡性腫瘤之一，在我國也是位居男性最尿系統(tǒng)腫瘤的前列，其發(fā)病率和死亡率逐年上升，由于其具有易復發(fā)性，膀胱的治療周期較長，患者承受的經(jīng)濟壓力和心理壓力均較大，給患者個人、家庭都造成了巨大的負擔[52]。膀胱癌發(fā)病機制復雜，發(fā)生發(fā)展與多種因素有關，
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.14

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

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2 周建波;劉修恒;陳暉;;B7-H4在膀胱癌腫瘤中表達的臨床意義[J];中華泌尿外科雜志;2014年02期

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相關博士學位論文 前1條

1 王永華;共刺激分子B7-H1在膀胱癌免疫逃逸和免疫治療中的作用研究[D];華中科技大學;2009年

相關碩士學位論文 前1條

1 李賢軍;B7-H1阻斷對膀胱癌患者外周血樹突狀細胞免疫功能的影響[D];青島大學;2014年

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本文編號：2709897