【摘要】：目的:見血封喉苷H(ToxH)是一種新型強心苷,我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)多種強心苷類化合物能引起腫瘤細胞損傷并通過線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。另外,還有研究發(fā)現(xiàn),強心苷能通過多種信號通路誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬。線粒體自噬(Mitophagy)是一種保護線粒體損傷的機制,我們前期研究發(fā)現(xiàn)強心苷可導(dǎo)致線粒體膜電位降低并通過線粒體途徑促使腫瘤細胞凋亡。為此,我們推測ToxH有可能通過線粒體自噬來保護損傷的細胞。因此,本課題利用分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)等研究手段,進一步了解ToxH是否能夠誘導(dǎo)A549和H460兩種肺癌細胞線粒體自噬,并研究其分子機理。方法:用不同劑量的ToxH處理A549和H460兩種肺癌細胞,并在不同的時間進行觀察和檢測,通過顯微鏡直接觀察細胞形態(tài),利用MTT實驗、EDU實驗檢測ToxH對肺癌細胞的生長和增殖的情況;通過JC-1染色,顯微鏡直接觀察結(jié)果并結(jié)合流式細胞術(shù)分析線粒體的膜電位變化;用Western Blotting方法檢測凋亡、線粒體自噬(包括自噬流)和信號通路相關(guān)的蛋白分子表達情況;同時用激光共聚焦顯微鏡觀察自噬標志分子(LC3、P62等)和線粒體自噬標志(Mito-Red)共聚現(xiàn)象,以了解是否產(chǎn)生線粒體自噬;通過RNA干擾(siRNA)或應(yīng)用自噬阻斷劑干擾相應(yīng)的分子并綜合以上方法分析ToxH誘導(dǎo)線粒體自噬與相關(guān)分子和自噬的關(guān)系;通過免疫共沉淀并結(jié)合Western Blotting實驗分析線粒體自噬與其相關(guān)分子之間的關(guān)系。結(jié)果:1、通過顯微鏡直接觀察發(fā)現(xiàn),鏡下ToxH處理的細胞數(shù)量隨著劑量增大逐漸變少,細胞間連接消失,細胞逐漸脫落,胞體形狀改變,死亡增多。MTT和EDU檢測結(jié)果表明,ToxH對肺癌細胞的生長和增殖有明顯的抑制作用。2、JC-1染色后在熒光顯微鏡下直接觀察,發(fā)現(xiàn)沒有ToxH處理的細胞呈明顯的紅色改變,但隨著ToxH劑量增加,細胞中綠色部分明顯增加;用流式細胞術(shù)定量分析膜電位有相同的變化;這些結(jié)果說明隨著ToxH劑量增加,線粒體膜電位發(fā)生改變和線粒體損傷增多。用Western Blotting檢測凋亡相關(guān)的表達分子,發(fā)現(xiàn)經(jīng)ToxH處理的肺癌細胞線粒體中的細胞色素C(Cyt c)的表達隨著ToxH處理時間的延長而越來越低,而胞質(zhì)中的Cyt c的表達則相應(yīng)增高;同時裂解的PARP、Caspase-3和Caspase-9的表達也相應(yīng)增高,但Caspase-8則沒有改變,說明ToxH通過損傷線粒體途徑誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡。3、用Western blotting檢測線粒體膜蛋白表達發(fā)現(xiàn),ToxH處理的細胞中Tom20、Tim23、Hsp60等分子的表達明顯下調(diào);用共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)ToxH處理的細胞中LC3斑點的數(shù)量明顯增多,并且這些LC3斑點和Mito-Red標記的線粒體以及P62分子均有明顯的共定位現(xiàn)象;用Western blotting檢測胞質(zhì)和線粒體中的自噬標志分子,發(fā)現(xiàn)ToxH處理的細胞的線粒體中含有更多的P62、LC3-II和Parkin,說明ToxH在肺癌細胞中通過Parkin通路誘導(dǎo)線粒體自噬。4、為了更進一步了解ToxH誘導(dǎo)肺癌細胞產(chǎn)生線粒體自噬的分子機理,通過Western blotting檢測Sirt3和Tom20的表達,發(fā)現(xiàn)ToxH處理的細胞中Sirt3表達明顯增高,但Tom20表達明顯減少;用RNA干擾Sirt3(siSirt3)表達后Tom20表達恢復(fù)正常;同樣在siSirt3并ToxH處理的肺癌細胞中,LC3斑點也沒有發(fā)現(xiàn)和Mito-Red有明顯的共聚現(xiàn)象,另外用RNA干擾Parkin(siParkin)或者用自噬阻斷劑抑制線粒體自噬后,發(fā)現(xiàn)ToxH處理的肺癌細胞的線粒體中也沒有檢測到明顯的P62、LC3-II和Parkin,這些結(jié)果說明ToxH通過誘導(dǎo)Sirt3高表達促使肺癌細胞產(chǎn)生線粒體自噬。5、為了明確ToxH誘導(dǎo)肺癌細胞高表達Sirt3的分子機理,我們用Western blotting檢測Sirt3、己糖激酶II(hexokinase II,Hex II)、Parkin和電壓依賴性陰離子通道蛋白1(VDAC1)之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)ToxH處理的細胞中Sirt3表達增高,總Hex II濃度和對照組未處理細胞之間表達差異并沒有明顯變化;實驗分別檢測胞質(zhì)和線粒體中的Hex II,發(fā)現(xiàn)ToxH處理后,胞質(zhì)中的Hex II明顯增高,這種現(xiàn)象在siStirt3的細胞中則沒有出現(xiàn),說明ToxH并不能促使Hex II重合成表達,而是促使主要分布在線粒體中的Hex II向胞質(zhì)轉(zhuǎn)移。用免疫共沉淀的方法檢測在過表達Parkin的肺癌細胞中VDAC1、Parkin和Hex II相互作用,發(fā)現(xiàn)控制組(siCtrl)中,ToxH處理的細胞中有明顯的Parkin和VDAC1共沉淀,沒有明顯的Hex II和VDAC1共沉淀,ToxH未處理的細胞(UT組)中Hex II和VDAC1共沉淀明顯,結(jié)果與ToxH組相反。干擾Sirt3表達后,(siSirt3-ToxH)組中Parkin和DVAC1共沉淀消失而Hex II和VDAC1發(fā)生共沉淀,UT組結(jié)果沒明顯變化。綜合以上結(jié)果,說明ToxH誘導(dǎo)肺癌細胞線粒體自噬是通過高表達Sirt3來下調(diào)Hex II與VDAC1結(jié)合并促使VDAC1和Parkin結(jié)合,進而激活線粒體自噬的Parkin通路。6、我們用干擾Sirt3和自噬阻斷劑3-MA抑制或阻斷ToxH誘導(dǎo)的自噬,然后重復(fù)用上述的方法檢測細胞的生長、增殖和凋亡情況,發(fā)現(xiàn)干擾或阻斷線粒體自噬后,ToxH抑制肺癌細胞生長增殖更加明顯,通過線粒體途徑凋亡的細胞明顯增加,說明ToxH誘導(dǎo)的線粒體自噬是一種保護性自噬。結(jié)論:實驗結(jié)果表明:1、ToxH抑制肺癌細胞生長和增殖;2、ToxH通過線粒體途徑誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡并能促使肺癌細胞產(chǎn)生線粒體自噬;3、ToxH誘導(dǎo)產(chǎn)生線粒體自噬是通過上調(diào)Sirt3表達并下調(diào)Hex II與VDAC1結(jié)合,進而促使VDAC1和Parkin結(jié)合,這可能是激活線粒體自噬經(jīng)典Parkin通路的一種機制;4、ToxH誘導(dǎo)的線粒體自噬是一種保護性的自噬,聯(lián)合線粒體自噬抑制劑或新型自噬阻斷技術(shù)有可能是增強ToxH抗腫瘤類藥物療效的重要策略。
【圖文】：

劑配制S液：取8 g NaCL，0.2 g KCL，2.88 g Na2HPO4·12H2O，0.2 g K離子水充分溶解，然后定容至1 L，4 °C保存?zhèn)溆谩６嗑奂兹┕潭ㄒ海簩?0 g 甲醛溶液溶解在800 ml去離子水中，并均勻攪拌，小心滴入1 N NaOH 溶液5~10滴，靜置待液體完液 PH 值到7.4~7.6之間，加入0.02 M 的 D-hanks 1 L，最后用2 L，充分混勻，小心過濾兩次，4 °C保存。％聚丙烯酰胺溶液：將290 g丙烯酰胺（Acr）和10 g亞甲雙小心加去離子水充分攪拌混勻，然后定容至1 L，4 °C避光保存泳緩沖液：小心將14.4 g 甘氨酸溶液，3 g Tris堿，1 g SDS, 去圖 1.見血封喉苷 H（ToxH）的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1. The chemical structure of toxicarioside H (ToxH)

化學(xué)藥物抗腫瘤作用最主要的特性就是能夠抑制腫瘤細胞生長和增殖，，為此我們先通過觀察細胞形態(tài)，然后利用 MTT 和 EDU 兩種體外實驗檢測 ToxH是否具有抑制 A549 和 H460 兩種肺癌細胞生長和增殖的作用。首先，將不同濃度（0.2、0.4、0.6 μM 三個劑量）的 ToxH 分別培養(yǎng) A549和 H460 肺癌細胞，對照組用 ToxH 溶劑 DMSO（培養(yǎng)方式和劑量與藥物培養(yǎng)細胞相同，等同于 ToxH（0 μM）作為陰性對照，用阿霉素（Doxorubicin，Dox，0.6 或 0.8 μM 兩個劑量）作為陽性對照。圖 2 是 ToxH 處理 24 小時后 A549和 H460 兩種細胞通過倒置顯微鏡觀察到的細胞形態(tài)，可見對照組（DMSO）的肺癌細胞在鏡下貼壁生長，細胞清晰，相鄰細胞融合緊密，隨著 ToxH 用藥劑量的增加，ToxH 處理的實驗組鏡下細胞單位面積數(shù)量逐漸變少，細胞間連接消失，細胞逐漸脫落，胞體形狀改變，死亡增多，說明 ToxH 對 A549 和 H460細胞具有細胞毒作用，這種細胞毒作用隨著 ToxH 藥物濃度的增加而增高。
【學(xué)位授予單位】：海南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2

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