【摘要】：自噬是真核生物中高度保守的細(xì)胞內(nèi)降解途徑,是一個(gè)對(duì)大多數(shù)細(xì)胞至關(guān)重要的分解代謝過程,它對(duì)通過循環(huán)細(xì)胞質(zhì)成分在應(yīng)激條件下維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞存活起到至關(guān)重要的作用。自噬是細(xì)胞內(nèi)最重要的蛋白質(zhì)降解途徑之一,可以促進(jìn)消除大部分的異常蛋白質(zhì)、多余或損傷的細(xì)胞器乃至整個(gè)生物體。巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬是自噬最基本的三種類型。它們發(fā)生的機(jī)制和功能是不同的。我們目前所說的自噬是巨自噬,它以能夠形成稱為自噬體的雙層膜囊泡為最顯著的特征。能夠誘導(dǎo)自噬的因素有很多,例如化學(xué)藥物雷帕霉素、缺氧和營養(yǎng)饑餓等。與酵母細(xì)胞中的自噬相比,哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的自噬是一個(gè)異常復(fù)雜的生理過程,涉及抗原遞呈、病原清除、細(xì)胞應(yīng)激、生存、衰老和死亡等過程�，F(xiàn)代研究表明,自噬與包括自身免疫性疾病、肌營養(yǎng)性疾病、帕金森病、心血管疾病、衰老和癌癥等多種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。雖然自噬與這些疾病的關(guān)系還沒有研究透徹,但是自噬作為治療多種疾病的靶標(biāo)已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、腸道中的局部介質(zhì)和血液中的血管活性劑。色氨酸、鎂、鋅和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)參與5-HT的合成。5-HT能夠影響人的情緒、睡眠和食欲等。人體內(nèi)的5-HT通過與相應(yīng)的受體特異性結(jié)合從而發(fā)揮作用,目前已有7種5-HT受體亞型被發(fā)現(xiàn)。已有研究表明,5-HT通過5-HT1和5-HT2受體在侵襲性癌癥和類癌中表現(xiàn)出生長刺激作用。選擇性5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑、5-HT受體拮抗劑和5-HT合成抑制劑已成功用于預(yù)防癌細(xì)胞生長等方面。另有研究表明,ROS能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬[1],且ROS在癌癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著非常重要的作用。基于自噬、ROS和5-HT均與癌癥的密切聯(lián)系,5-HT能否誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬已經(jīng)成為一個(gè)值得研究的問題。本文以Hep G2和Hep3B細(xì)胞為模式細(xì)胞,對(duì)5-HT能否誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬及可能的機(jī)制進(jìn)行初步研究。首先,我們建立了帶有GFP-LC3質(zhì)粒的Hep G2和Hep3B細(xì)胞系,用不同濃度的5-HT處理不同時(shí)間后,在熒光顯微鏡下觀察Hep G2和Hep3B細(xì)胞的GFP-LC3熒光斑點(diǎn);利用western blot技術(shù)檢測Hep G2和Hep3B細(xì)胞中自噬標(biāo)志蛋白LC3和p62的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,5-HT均能夠誘導(dǎo)Hep G2和Hep3B細(xì)胞內(nèi)GFP-LC3斑點(diǎn)增多,而且我們明確了5-HT對(duì)自噬的最佳誘導(dǎo)濃度和最佳誘導(dǎo)時(shí)間;5-HT能夠顯著增強(qiáng)Hep G2和Hep3B細(xì)胞中LC3蛋白的表達(dá)量和p62蛋白的降解。其次,我們用western blot技術(shù)檢測了不同濃度的5-HT處理不同時(shí)間后Hep G2和Hep3B細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白m TOR、4E-BP1、p70S6K、AMPKα、AMPKβ、ERK、p38、JNK、ULK1蛋白的磷酸化水平。利用western blot分析了用PD 98059(ERK抑制劑)、SP 600125(JNK抑制劑)和SB 203580(p38抑制劑)預(yù)處理,5-HT處理后Hep G2和Hep3B細(xì)胞內(nèi)的ERK、JNK和p38蛋白的磷酸化水平和LC3蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明,5-HT不能抑制Hep G2和Hep3B細(xì)胞中m TOR、4E-BP1、p70S6K的磷酸化,但能夠誘導(dǎo)ULK1、AMPKα、AMPKβ、JNK、ERK、p38的磷酸化;SP 600125可抑制5-HT誘導(dǎo)的JNK、ERK、p38的磷酸化,SB 203580可抑制5-HT誘導(dǎo)的p38、ERK的磷酸化,PD 98059可抑制5-HT誘導(dǎo)的ERK的磷酸化,因此,5-HT誘導(dǎo)Hep G2和Hep3B細(xì)胞自噬發(fā)生是依賴于JNK/p38/ERK途徑的。最后,我們利用DHR 123探針以及熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的水平,結(jié)果顯示5-HT能夠誘導(dǎo)Hep G2和Hep3B細(xì)胞ROS增多,且ROS清除劑NAC顯著抑制了5-HT誘導(dǎo)的Hep G2和Hep3B細(xì)胞的GFP-LC3熒光斑點(diǎn)及western blot結(jié)果的LC3-II蛋白表達(dá)水平,表明ROS為5-HT誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬所必須。本研究結(jié)果表明,5-HT能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬且是通過激活A(yù)MPK/ULK1和JNK/ERK/p38途徑的磷酸化而不是通過抑制m TOR途徑的磷酸化誘導(dǎo)了肝癌細(xì)胞自噬的發(fā)生,并且5-HT誘導(dǎo)兩種細(xì)胞ROS產(chǎn)量顯著升高,且ROS參與了5-HT誘導(dǎo)的自噬的發(fā)生。
【圖文】：

-HT的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure1.1Chemicalstructureof5-HT

圖 1.1 熒光顯微鏡觀察經(jīng)5-HT處理后Hep3B和HepG2細(xì)胞中的GFP-LC3斑點(diǎn)，，***表示5-HT和Rapa與control的數(shù)據(jù)顯著性比較；###表示5-HT + wortmannin和Rapa + wortmannin與5-HT和Rapa的數(shù)據(jù)顯著性比較Fig.1.1 The GFP-LC3 puncta detected by fluorescence microscopy of in Hep3B and
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 陳燕鋒;曾群力;;自噬與代謝及代謝性疾病[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2015年02期

2 陳莉君;史道華;;mTOR結(jié)合蛋白的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2012年11期

3 代守前;余利鵬;韋永中;吳昊;;腸源性血清素對(duì)骨代謝的影響[J];中華骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病雜志;2012年03期

4 楊芬;高幼衡;吳克偉;;倍半萜類化合物Hirsutanol激活ROS誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬性死亡(英文)[J];癌癥;2010年07期

本文編號(hào)：2706545