【摘要】：目的篩選出與食管鱗癌干細(xì)胞放射敏感性相關(guān)的LncRNA。方法對(duì)人食管鱗癌細(xì)胞株Eca109進(jìn)行無血清培養(yǎng)形成富集干細(xì)胞的懸浮細(xì)胞球(瘤球細(xì)胞組)和正常血清培養(yǎng)形成的細(xì)胞(貼壁細(xì)胞組)。分別通過CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成等實(shí)驗(yàn)初步確定瘤球細(xì)胞是否具有干細(xì)胞特性。驗(yàn)證CD44是否為食管鱗癌干細(xì)胞標(biāo)志物。通過流式分選技術(shù)從瘤球細(xì)胞組中分選出CD44+食管鱗癌干細(xì)胞,從貼壁細(xì)胞組中分選出CD44-食管鱗癌細(xì)胞,再用LncRNA高通量測序分析CD44+食管鱗癌干細(xì)胞與CD44-食管鱗癌細(xì)胞細(xì)胞間的LncRNA差異表達(dá)譜,并應(yīng)用Real-time PCR方法驗(yàn)證篩選與食管鱗癌干細(xì)胞放射敏感性相關(guān)的特異性LncRNA。結(jié)果1.人食管鱗癌干細(xì)胞的細(xì)胞球(瘤球細(xì)胞)培養(yǎng)條件的摸索及確定:結(jié)果顯示使用1×10~5個(gè)/ml密度進(jìn)行培養(yǎng)所獲得瘤球細(xì)胞生長狀態(tài)良好。2.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h、72h后瘤球細(xì)胞組的吸光度值較貼壁細(xì)胞組均明顯的升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。瘤球細(xì)胞組細(xì)胞克隆形成率較貼壁細(xì)胞組高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:根據(jù)放射敏感性參數(shù)分析,與貼壁細(xì)胞組比較,瘤球細(xì)胞組的D0、Dq、N和SF2值明顯升高,放射增敏比為1.556。4.流式細(xì)胞儀檢測CD44結(jié)果顯示:瘤球細(xì)胞組CD44的表達(dá)率和量均較貼壁細(xì)胞組高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.LncRNA高通量測序分析結(jié)果顯示:流式分選技術(shù)分選出的CD44+食管鱗癌干細(xì)胞與CD44-食管鱗癌細(xì)胞,采用LncRNA高通量測序分析,并選取|log2Ratio|≥1和q0.05的基因作為顯著差異表達(dá)篩選條件,篩得4961個(gè)基因在兩組細(xì)胞中表達(dá)呈顯著差異,與CD44-食管鱗癌細(xì)胞相比,CD44+食管鱗癌干細(xì)胞組2517個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào);2444個(gè)基因顯著下調(diào),其中mRNA3129個(gè),1479,上調(diào),1695個(gè)下調(diào);lncRNA1832個(gè),1038個(gè)上調(diào),794個(gè)下調(diào)。6.Realtime PCR結(jié)果顯示:選擇前10位差異性表達(dá)最大的LncRNA基因(其中CH17-360D5.2、CH17-360D5.3、AC113607.2、RP11-439E19.10、MSTRG.424、MSTRG.64087、MSTRG.116589、MSTRG.15903上調(diào),RP13-895J2.7、MSTRG.73085下調(diào))進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示:MSTRG.73085表達(dá)下調(diào),其平均表達(dá)水平約為20.7倍(LncRNA高通量測序分析為49.3倍),CH17-360D5.2、RP11-439E19.10、MSTRG.424、MSTRG.64087、MSTRG.15903表達(dá)上調(diào),其平均表達(dá)水平分別為2.7、8.7、3.7、5、7倍(LncRNA高通量測序分析分別為8.2、5.2、78.9、3、4.7倍)。結(jié)論1.人食管鱗癌細(xì)胞株Eca109無血清培養(yǎng)能夠獲得懸浮的富集人食管鱗癌干細(xì)胞的細(xì)胞球,CD44可能是人食管鱗癌干細(xì)胞的標(biāo)志物。2.應(yīng)用LncRNA高通量測序結(jié)合Realtime PCR技術(shù)驗(yàn)證篩查差異表達(dá)基因,與貼壁細(xì)胞組相比,其中MSTRG.73085在瘤球細(xì)胞組中表達(dá)顯著下調(diào),CH17-360D5.2、RP11-439E19.10、MSTRG.424、MSTRG.64087、MSTRG.15903表達(dá)顯著上調(diào),這些差異性LncRNA基因有可能與食管鱗癌干細(xì)胞的放射敏感性相關(guān),有望成為食管鱗癌潛在的藥物治療新靶點(diǎn)和指導(dǎo)食管鱗癌的個(gè)體化放射治療。
【圖文】：

長情況如圖 1-3 所示，結(jié)果顯示使用 1×105個(gè)/ml 密度進(jìn)行培養(yǎng)所獲得瘤長狀態(tài)良好，選擇該密度進(jìn)行瘤球細(xì)胞的大量培養(yǎng)。Eca109 貼壁細(xì)胞和瘤球細(xì)胞的生長曲線正常培養(yǎng)的貼壁生長的 Eca109 細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，分別測定 Eca109 貼壁球細(xì)胞在 0h，24h，，48h，72h 細(xì)胞活性，繪制瘤球與貼壁細(xì)胞生長曲線胞活性均高于貼壁細(xì)胞（P<0.05，圖 4，表 1）。表 1 Eca109 貼壁細(xì)胞與瘤球細(xì)胞的增殖情況對(duì)比別 0 24h 48h 72h細(xì)胞 0.1751±0.01382 0.4358±0.01831 0.7686±0.06916 1.460±0.0細(xì)胞 0.1430±0.01744 0.5703±0.04437 1.096±0.05481 1.698±0.0P 0.0271 0.0008 0.0005 0.004

瘤球細(xì)胞生長情況（×200，1×106個(gè)/ml）
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Jian-Lin Wang;Jing-Ping Yu;Zhi-Qiang Sun;Su-Ping Sun;;Radiobiological characteristics of cancer stem cells from esophageal cancer cell lines[J];World Journal of Gastroenterology;2014年48期

本文編號(hào)：2706239