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Olaparib聯合CBP、BKM120對三陰性乳腺癌的細胞抑制作用及其機制研究

發(fā)布時間:2020-06-06 15:18
【摘要】:研究背景及目的:三陰性乳腺癌作為乳腺癌分子分型中的一種,特點是雌激素受體、孕激素受體以及人表皮生長因子2均不發(fā)生表達。癌癥基因組圖譜揭示了三陰性乳腺癌這類腫瘤可能存在大量的拷貝數改變,p53突變,PI3K通路激活,以及DNA損傷修復和同源重組(HR)缺陷等。因此,傳統的化療方案在這部分分子分型的腫瘤中獲益不佳,至今為止三陰性乳腺癌的治療也依然沒有標準的治療方案,這些現狀急需針對三陰性乳腺癌的更有效的靶向治療方案的推出。Olaparib、PI3K抑制劑和卡鉑(CBP)均已被證實單獨應用在三陰性乳腺癌中為安全和有效的。在臨床I期實驗中也證實了BKM120和Olaparib可以聯合使用,且不存在藥物的互相作用,這種有效性在BRCA突變和BRCA未突變的患者中均觀察到了臨床獲益。因此,我們根據這三種藥物的藥理機制參考臨床使用方案,設計了三藥聯合的作用在三陰性乳腺癌細胞系的實驗。本研究的主要目的在于探究三藥聯合使用在TNBC細胞系中對細胞生長抑制的效果,并通過相關實驗進一步研究其作用機制,并為未來的動物實驗和臨床試驗提供有力的證據。研究方法:1.利用細胞增殖實驗(MTT)方法對三陰性乳腺癌細胞系CAL51、MDA-MB-231和激素受體陽性的細胞系MCF-7的細胞分別進行Olaparib、CBP、BKM120三種藥物單藥或三藥聯合兩種方案處理后,得到其各自的IC50值,從而評估對細胞生長的抑制作用,并使用Calcusyn2.0軟件計算三藥的聯合指數(combination index CI),判斷三種藥物聯合使用是否存在藥物的協同作用。2.利用平板克隆形成實驗,評價Olaparib、CBP、BKM120三種藥物分別以單藥、雙藥、三藥多種給藥方案處理后,對于CAL51和MDA-MB-231的細胞克隆形成的抑制作用。3.利用流式細胞技術檢測Olaparib、CBP、BKM120三種藥物分別以單藥、雙藥或三藥處理多種藥物處理后,對于CAL51和MDA-MB-231的細胞周期的影響,以明確三藥聯合是否對細胞周期發(fā)生作用從而達到抑制細胞生長的作用。4.采用Western blotting技術檢測在Olaparib、CBP、BKM120三種藥物對分別以不同濃度單藥處理后,檢測CAL51和MDA-MB-231的細胞中H2AX、cleaved-PARP、PADPR、ATM、Chk1和Chk2蛋白的表達,以推測其對于DNA損傷的作用。5.采用Western blotting技術檢測在Olaparib、CBP、BKM120三種藥物分別在單藥、雙藥或三藥不同方案處理后,對CAL51和MDA-MB-231的細胞檢測其H2AX、PADPR、53BP1、p27、p21和p-ATM等蛋白的表達情況,以推測使用三藥后對細胞的DNA損傷及DNA修復HR通路和NHEJ通路的影響。6.利用免疫熒光方法技術進一步了解Olaparib、CBP、BKM120三種藥物分別在單藥、雙藥或三藥不同方案處理后對CAL51和MDA-MB-231的細胞的DNA損傷程度的影響,并進一步研究三藥聯合使用對DNA修復的HR通路和NHEJ通路的活化情況的影響。研究結果:1.當Olaparib單獨使用在CAL51和MDA-MB-231細胞系中,在CAL51細胞系中其IC50為44.12(μM),在MDA-MB-231細胞系中其IC50為95.07(μM),可見Olaparib單藥使用在非BRCA突變的三陰性乳腺癌細胞系中其細胞殺傷作用非常有限。當Olaparib作用在激素受體陽性的MCF-7細胞系中,其IC50為2237μM,無明顯細胞生長抑制作用。2.Olaparib、CBP和BKM120三種藥物聯合使用后,聯合指數CI值在CAL51和MDA-MB-231中中均小于1.0,且大部分數據0.8,這證明三藥具有較強的協同作用。而在MCF-7細胞系中卻無類似協同作用出現。3.在細胞功能學實驗中,當低濃度使用Olaparib、CBP、BKM120三種藥物中的單藥或聯合使用雙藥時,其抑制細胞生長的作用比較有限,而當低濃度三藥聯合使用時卻能夠有效抑制細胞克隆的形成。4.在細胞周期檢測中發(fā)現,Olaparib、CBP、BKM120三藥聯合使用后,細胞周期阻滯作用明顯增強,表現在CAL51細胞系中G2/M期細胞明顯增多(20.6%),MDA-MB-231細胞系中的S期細胞明顯增多(10.1%)。兩種細胞系在三藥作用后處于G0/G1期的細胞比例較對照組均明顯減少。而當比較OLA+CBP雙藥組和三藥組時,由于BKM120的加入,G1期細胞比例明顯增加。5.采用Western blotting技術檢測發(fā)現,Olaparib、CBP、BKM120單藥處理CAL51和MDA-MB-231兩個細胞系后,H2AX,p-CHK1和p-CHK2的表達均明顯增多,PADPR的表達均明顯降低,證明三種藥物處理后DNA損傷的相關蛋白表達明顯增多,三藥均具有導致腫瘤細胞DNA損傷的作用,且隨藥物劑量的增加,DNA損傷更為明顯。6.在Olaparib、CBP、BKM120三藥聯合使用后,除了DNA損傷增加以外,NHEJ修復通路的蛋白53BP1,p53和p-ATM表達也明顯增加,進而證明了三藥的聯合使用導致了NHEJ修復通路活化的增加。三藥組與OLA+CBP雙藥組相比,p27和p21表達明顯增加,反應了BKM120的加入增加了對PI3K通路的抑制作用,激活了細胞周期的G1期阻滯。7.通過免疫熒光實驗,Olaparib、CBP、BKM120三藥聯合使用與對照組相比,γ-H2AX熒光表達明顯增加,說明三藥使用增加了細胞的DNA損傷,而導致代表了HR通路的DNA修復的RAD51和HR修復通路中的重要成分BRCA1的熒光表達較較雙藥組明顯降低,53BP1的表達卻明顯升高。從而證明雙鏈DNA損傷增加,但HR修復途徑被抑制,導致NHEJ修復途徑增多,可能造成DNA損傷修復的正確率下降,從而導致腫瘤細胞死亡。研究結論:本研究發(fā)現并證實了Olaparib、CBP、BKM120三藥聯合使用的有效性。三藥聯合使用通過DNA損傷協同作用于三陰性乳腺癌細胞,抑制同源重組修復(HR)途徑,增加其非同源末端連接(NHEJ)通路進行DNA修復,從而導致DNA損傷增加、修復能力下降,最終增強其對三陰性乳腺癌細胞的殺傷作用。本研究為Olaparib聯合CBP和BKM120的治療應用提供了強有力的理論基礎。
【圖文】:

三陰,殺傷作用


24A-1C Olaparib 單獨使用在三陰性乳腺癌細胞 CAL51 和 MDA-M殺傷作用非常有限。用 MTT 法測定三陰性乳腺癌細胞 MDA-ML51 細胞,以及 MCF-7(非三陰性乳腺癌細胞系)的半抑制濃度(A)OLA,(B)CBP,或(C)BKM120。OLA:Olaparib;CBP:卡P-BKM120;Cell inhibition(%):細胞抑制率(%);IC50,半抑制濃

聯合應用,細胞系,卡鉑,數據


C 為 CAL51、MDA-MB-231、MCF-7 三種細胞系使用三藥聯合應用結果。結果為三次獨立實驗的結果計算其平均值±標準差。*P<0.a代表單藥的敏感曲線顯示在圖 1A-C;b代表三藥聯合使用后的敏感 2A-C. BKM120:NVP-BKM120; CBP:卡鉑; IC50:半抑制濃度。e IC50(μM)Drug aloneaIC50(μM)Drug combinationbOlaparib CBP BKM120 Olaparib CBP BKM 44.1 1.2 4.8 3.3 0.8 0.6MB-231 95.1 16.5 11.1 12.5 3.1 2.5表格 1
【學位授予單位】:天津醫(yī)科大學
【學位級別】:博士
【學位授予年份】:2018
【分類號】:R737.9

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