【摘要】：前言腎細(xì)胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)是成人最常見(jiàn)的腎臟惡性腫瘤,近年來(lái)腎癌流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,腎癌特別是腎細(xì)胞癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。由于復(fù)雜的發(fā)病特點(diǎn)及遺傳學(xué)、組織學(xué)的多樣性,腎細(xì)胞癌缺乏臨床上特異性的分子診斷標(biāo)記物。因此,臨床上針對(duì)腎癌的早期診斷,預(yù)后評(píng)價(jià),術(shù)后跟蹤及靶向治療效果判定等方面仍然缺乏有效手段。近年來(lái),針對(duì)腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制研究顯示,以抑癌基因VHL突變失活及其下游缺氧誘導(dǎo)因子HIF-VEGF分子通路激活為基礎(chǔ)的缺氧誘導(dǎo)新生血管形成機(jī)制是最重要的腎癌分子病理基礎(chǔ)之一。同時(shí),針對(duì)腎癌的代謝組學(xué)相關(guān)研究提示,在低氧狀態(tài)下,腎細(xì)胞癌的能量代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。因此,針對(duì)腫瘤的代謝調(diào)控成為近年來(lái)腎癌治療的熱點(diǎn)方向。蛋白質(zhì)翻譯后修飾(Posttranslational modifications,PTMs)是指蛋白質(zhì)在翻譯后經(jīng)歷的共價(jià)加工過(guò)程,通常是通過(guò)對(duì)其特定的氨基酸殘基加上修飾基團(tuán)或經(jīng)蛋白水解剪去基團(tuán)的過(guò)程。PTMs通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性、穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位以及蛋白質(zhì)間相互作用,促進(jìn)了蛋白質(zhì)的功能多樣性,是擴(kuò)大基因編碼、調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能的有效機(jī)制,并與幾乎所有已知的細(xì)胞通路和疾病相關(guān)。隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展,越來(lái)越多的PTMs類型被鑒定出來(lái)。有證據(jù)表明,蛋白質(zhì)翻譯后修飾在不同的生物過(guò)程,如細(xì)胞的調(diào)節(jié)分化和有機(jī)體的發(fā)育以及多種物質(zhì)代謝等過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。異常的蛋白質(zhì)翻譯后修飾可能與包括腫瘤在內(nèi)的多疾病密切相關(guān)。賴氨酸琥珀�；揎検切陆l(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型,是琥珀�；w通過(guò)酶學(xué)或者非酶學(xué)的方式將琥珀酰基團(tuán)共價(jià)結(jié)合到賴氨酸殘基的過(guò)程。琥珀酰化是通過(guò)酶學(xué)或者非酶學(xué)的方式將一個(gè)負(fù)電荷四碳琥珀�；鶊F(tuán)共價(jià)結(jié)合到賴氨酸殘基的伯胺上的過(guò)程。相較于甲基化和乙�；刃揎�,琥珀�；梢詡鬟f更大的結(jié)構(gòu)基團(tuán)并誘導(dǎo)蛋白電荷出現(xiàn)更大的改變。因此,蛋白質(zhì)的賴氨酸琥珀�；揎椏赡艽龠M(jìn)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生更加明顯的實(shí)質(zhì)性改變。目前通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)鑒定分析,許多代謝酶包括糖酵解,三羧酸循環(huán)、脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶都發(fā)生了琥珀�；揎棥＿@可能提示琥珀�；揎棌V泛參與了與能量代謝相關(guān)的生物過(guò)程,并發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。但蛋白質(zhì)賴氨酸琥珀酰化修飾對(duì)蛋白質(zhì)的具體調(diào)控機(jī)制仍然不夠明確。目前針對(duì)琥珀�；揎棇�(duì)腫瘤進(jìn)程的作用也少有報(bào)道。因此,本研究擬通過(guò)對(duì)腎細(xì)胞癌組織的蛋白組與賴氨酸琥珀�；揎椊M的鑒定和分析,探討腎細(xì)胞癌組織中琥珀酰化修飾的表達(dá)水平及其對(duì)腎癌能量代謝過(guò)程的潛在作用,為腎細(xì)胞癌的診斷及靶向治療提供新的思路和方向。方法一、樣本收集(一)腎細(xì)胞癌組織樣本收集本研究對(duì)腎細(xì)胞癌組織樣本的收集獲得了中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)和支持。我們共收集了9對(duì)腎細(xì)胞癌及與之對(duì)應(yīng)的癌旁組織用于LC-MS/MS的鑒定分析,10對(duì)腎細(xì)胞癌及癌旁組織液氮凍存標(biāo)本,以及45對(duì)腎細(xì)胞癌及癌旁組織石蠟包埋標(biāo)本。這些標(biāo)本取自2015年9月至2017年12月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科接受手術(shù)治療的腎細(xì)胞癌患者。所有患者術(shù)前均簽署了科研知情同意書(shū)。所有患者術(shù)前均未接受任何治療,所有標(biāo)本術(shù)后病理診斷均為腎透明細(xì)胞癌。(二)細(xì)胞培養(yǎng)本研究培養(yǎng)了OSRC、769-P、ACHN腎癌細(xì)胞系,細(xì)胞系均來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科研究所。二、檢測(cè)方法(一)蛋白質(zhì)組和賴氨酸琥珀�；揎椊M的定量分析利用LC-MS/MS技術(shù)鑒定腎癌及癌旁組織中的蛋白組表達(dá),定量差異表達(dá)蛋白;利用琥珀�；嚎贵w富集,經(jīng)LC-MS/MS鑒定琥珀�；揎椊M的表達(dá),定量差異表達(dá)位點(diǎn)及相關(guān)蛋白。(二)差異蛋白組及差異琥珀�；揎椊M的富集和功能分析通過(guò)GO、KEGG pathway對(duì)鑒定到的差異蛋白及差異表達(dá)的琥珀�；揎椢稽c(diǎn)進(jìn)行功能富集,明確差異蛋白尤其是差異的琥珀�；揎椏赡軈⑴c的生物學(xué)過(guò)程。(三)分析差異蛋白組及差異表達(dá)的琥珀�；揎椢稽c(diǎn)的相關(guān)性構(gòu)建蛋白-蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò),標(biāo)準(zhǔn)化差異琥珀酰化修飾位點(diǎn),明確差異蛋白及差異琥珀�；揎椢稽c(diǎn)的相關(guān)性,篩選出潛在的作用靶點(diǎn)。(四)檢測(cè)PGK1及PKM2在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)通過(guò)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)提取分析PGK1及PKM2的基因水平表達(dá)。Western blot檢測(cè)腎細(xì)胞癌組織中PGK1及PKM2蛋白的表達(dá)。(五)分析PGK1蛋白的臨床意義免疫組化檢測(cè)腎細(xì)胞癌組織中PGK1的原位表達(dá)情況,分析PGK1蛋白表達(dá)水平與腎細(xì)胞癌組織病理分級(jí)的相關(guān)性。(六)檢測(cè)PGK1的琥珀酰化修飾在腎細(xì)胞組織中的表達(dá)免疫沉淀富集腎細(xì)胞癌組織及癌旁組織中PGK1蛋白,利用琥珀�；嚎贵w檢測(cè)PGK1的琥珀�；揎椀谋磉_(dá)水平。(七)細(xì)胞水平檢測(cè)PGK1對(duì)腎癌細(xì)胞生物行為學(xué)的影響利用RNAi技術(shù)干擾腎癌細(xì)胞系OSRC和ACHN中PGK1的內(nèi)源性表達(dá),通過(guò)CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力變化,通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力變化。(八)檢測(cè)SIRT5對(duì)PGK1的琥珀酰化修飾水平的影響通過(guò)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)提取SIRT5基因在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況。在腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN中過(guò)表達(dá)SIRT5,應(yīng)用免疫沉淀富集PGK1,Western blot檢測(cè)PGK1琥珀�；磉_(dá)水平。(九)細(xì)胞水平檢測(cè)Sirt5對(duì)腎癌細(xì)胞生物行為學(xué)的影響通過(guò)CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力變化,通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力變化。結(jié)果一、腎細(xì)胞癌組織中差異蛋白質(zhì)組和賴氨酸琥珀�；揎椊M的定量分析通過(guò)高分辨率LC-MS/MS分析,我們從這9對(duì)RCC組織樣本中共鑒定出4116個(gè)蛋白質(zhì),其中3217個(gè)蛋白質(zhì)可以量化。經(jīng)過(guò)閾值篩選,有668種蛋白質(zhì)在腫瘤組織及癌旁組織中存在差異表達(dá),包括了189個(gè)上調(diào)和479個(gè)下調(diào)蛋白。在這9對(duì)RCC組織樣本中,我們共鑒定到了1090個(gè)蛋白質(zhì)中1668個(gè)賴氨酸琥珀�；揎�(Ksucc)位點(diǎn),其中844個(gè)蛋白中的1238個(gè)Ksucc位點(diǎn)被定量。與癌旁組織相比,我們?cè)谀[瘤組織中篩選到47個(gè)蛋白質(zhì)中的51個(gè)Ksucc位點(diǎn)表達(dá)上調(diào),95個(gè)蛋白質(zhì)中的110個(gè)Ksucc位點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。二、差異蛋白組及差異琥珀酰化修飾組的富集和功能分析我們通過(guò)對(duì)差異蛋白組及差異琥珀�；揎椊M的GO富集和KEGG pathway分析,發(fā)現(xiàn)上調(diào)的琥珀酰化修飾蛋白富集于糖酵解、氨基酸的生物合成和hHIF-1信號(hào)通路的相關(guān)蛋白。與之相對(duì),琥珀�；揎椣抡{(diào)的蛋白質(zhì)富集在碳代謝、TCA循環(huán)和脂肪酸代謝等通路過(guò)程中。我們進(jìn)一步對(duì)琥珀�；稽c(diǎn)及其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)量做了關(guān)聯(lián)分析。篩選出HspB1、FGA、COL6A3、FN、PGK1、PKM等蛋白的琥珀酰化修飾最為顯著。需要在組織和細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證。三、PKM2、PGK1及其琥珀�；揎椩谀I細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義通過(guò)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)提取的關(guān)于PGK1和PKM2基因在腫瘤中的芯片數(shù)據(jù),我們發(fā)現(xiàn)PGK1和PKM2 mRNA在RCC組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài);Western blot檢測(cè)PGK1和PKM2蛋白在RCC組織中同樣呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。免疫沉淀富集PGK1蛋白后應(yīng)用琥珀�；嚎贵w檢測(cè)結(jié)果顯示免疫組化結(jié)果顯示:PGK1在RCC腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),并定位于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中。染色評(píng)分與RCC病理分級(jí)呈顯著的正相關(guān)。四、細(xì)胞水平檢測(cè)PGK1對(duì)腎癌細(xì)胞增殖及遷移能力的影響我們通過(guò)RNAi技術(shù)構(gòu)建了PGK1特異siRNA,抑制了腎癌細(xì)胞系OSRC和ACHN中的PGK1表達(dá)水平。CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染siRNA后,與對(duì)照組相比較,OSRC和ACHN的細(xì)胞增殖能力明顯下降。Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染siRNA后,與對(duì)照組相比較,OSRC和ACHN的細(xì)胞遷移能力也明顯受到抑制。五、檢測(cè)SIRT5對(duì)PGK1的琥珀酰化修飾水平及對(duì)腎癌細(xì)胞增殖及遷移能力的影響我們首先通過(guò)對(duì)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中腎癌組織基因芯片數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)SIRT5mRNA在腎細(xì)胞癌組織中明顯降低。我們?cè)贏CHN細(xì)胞中構(gòu)建了SIRT5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,上調(diào)了細(xì)胞的SIRT5內(nèi)源性表達(dá)。通過(guò)免疫沉淀富集PGK1,利用泛琥珀�；揎椏贵w檢測(cè)結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)SIRT5的ACHN細(xì)胞中,PGK1的琥珀�；揎検艿矫黠@抑制。CCK8及Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)SIRT5后,腎癌細(xì)胞的增殖能力和遷移能力均出現(xiàn)顯著下降。六、統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)顯示,統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行。配對(duì)樣本數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn),隨機(jī)樣本組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。判定差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為P0.05。結(jié)論1、在RCC中,存在較高豐度的賴氨酸琥珀�；揎椢稽c(diǎn),并且其差異表達(dá)的蛋白集中于糖酵解、氧化磷酸化、TCA循環(huán)、脂肪酸代謝等能量代謝通路中。2、糖酵解關(guān)鍵酶PKM2、PGK1及其賴氨酸琥珀酰化修飾在腎細(xì)胞癌中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。免疫組化結(jié)果顯示:PGK1在RCC組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),并定位于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中。PGK1染色評(píng)分與RCC病理分級(jí)呈顯著的正相關(guān)。3、PGK1能夠顯著影響腎癌細(xì)胞的增殖能力和遷移能力。4、SIRT5在腎癌組織中呈低表達(dá)狀態(tài),并可能通過(guò)其去琥珀�；拿富钚哉{(diào)控PGK1的琥珀酰化修飾,從而影響腎癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。
【圖文】：

10圖 1.1 在 RCC 及其癌旁組織中定量分析全蛋白質(zhì)組和賴氨酸琥珀�；揎椀南到y(tǒng)工作流程3.2 RCC 及癌旁組織中全蛋白質(zhì)組的鑒定與功能分析3.2.1 RCC 及癌旁組織中全蛋白質(zhì)組的鑒定

圖 1.2 RCC 及其癌旁組織中對(duì)全蛋白質(zhì)組的識(shí)別和功能分析注：A 和 B 為通過(guò) GO 功能富集分析得到的上調(diào)和下調(diào)的蛋白；C 和 D 為通過(guò)KEGG pathway 分析得到的上調(diào)和下調(diào)的蛋白。3.2.3 KEGG pathway 分析糖酵解/氧化磷酸化通路相關(guān)的差異蛋白具體來(lái)說(shuō)，相比于癌旁組織，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的能量代謝的變化。線粒體中上調(diào)的糖酵解和下調(diào)的氧化磷酸化過(guò)程表明，在 RCC 組織中葡萄糖可以通過(guò)厭氧而不是的有氧途徑來(lái)代謝供能的。基于糖酵解途徑數(shù)據(jù)(圖 1.3A)，，我們發(fā)現(xiàn)與糖酵解有關(guān)的主要蛋白質(zhì)和關(guān)鍵酶明顯增加，而對(duì)檸檬酸循環(huán)至關(guān)重要的相關(guān)酶卻大量減少了。與此同時(shí)，許多與線粒體氧化磷酸化過(guò)程相關(guān)的蛋白表達(dá)量也明顯減少(圖1.3B)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.11

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 朱偉偉;韋嬪;;廢蠶絲中絲素蛋白的琥珀�；男匝芯縖J];廣東化工;2014年03期

2 李浩;王征科;胡巧玲;;N-琥珀酰殼聚糖的制備及其性能[J];材料科學(xué)與工程學(xué)報(bào);2011年04期

3 吳景;楊光;楊鵬飛;;琥珀酰化對(duì)玉米醇溶蛋白消化率的影響[J];食品工業(yè)科技;2007年01期

4 張軍濤;李理;楊曉泉;;琥珀�；撝蛊闪髯冃再|(zhì)研究[J];現(xiàn)代食品科技;2007年08期

5 張紅印,朱加進(jìn),鄭曉冬,席q芳,王蘭;小麥面筋蛋白琥珀�；男匝芯縖J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2003年03期

6 李蓉;陳雪嵐;;蛋白質(zhì)賴氨酸殘基的琥珀�；揎梉J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2018年12期

7 李銘;熊小英;謝晶;薛斌;銀旭紅;孫濤;;N-琥珀酰低聚殼聚糖的抗氧化性能研究(英文)[J];天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā);2014年10期

8 張軍濤;楊曉泉;黃立新;;琥珀酰化脫脂豆粕粘合性質(zhì)及流變性質(zhì)研究[J];中國(guó)油脂;2007年11期

9 汪琴;王麗;王愛(ài)勤;;不同因素對(duì)N-琥珀酰殼聚糖特性黏度的影響[J];中國(guó)生化藥物雜志;2005年06期

10 汪琴,王愛(ài)勤;N-琥珀酰殼聚糖的合成和性能研究[J];功能高分子學(xué)報(bào);2004年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 R壚

本文編號(hào)：2697876