【摘要】：我國擁有豐富的海洋資源,因為海洋地域的特殊性,海洋生物中油脂的化學特性、生物功能、結(jié)構(gòu)特性等方面與陸地生物脂類具有明顯的不同。但海洋生物中獲得天然脂類擁有很強的生理活性,存在很大的研究潛力。我國對海洋生物活性物質(zhì)的研究已取得很大的進展�，F(xiàn)研究表明,海膽擁有很強的生物功能及其藥理活性,并在抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫活性等方面取得初步進展。但海膽油脂的生理學功能這一方面的研究還有很大的空白。光棘球海膽,拉丁名為Strongylocentrotus nudus,民間稱之為大連紫海膽。海膽油脂(SUL)通過色譜氣質(zhì)分析脂肪酸的組成發(fā)現(xiàn),海膽油脂中脂肪酸含量豐富,其中含29種脂肪酸,其中對抗腫瘤活性存在潛在價值的PUFAω-3和ω-6各占31.83%和14.66%,具有潛在促其癌細胞凋亡的功能。EPA脂肪酸占比13.33%,DHA脂肪酸占比2.13%,文獻中明確提到這兩種PUFA存在抗腫瘤效果;在此基礎之上,本實驗研究SUL協(xié)同抑制腫瘤細胞擴增轉(zhuǎn)移五氟尿嘧啶(5-FU)對體外培養(yǎng)人類肝癌組織細胞(HepG2細胞)抗腫瘤活性的影響。采用MTBE法提取SUL,之后通過氣相色譜-質(zhì)譜中檢測到的各組分保留時間,以及與脂肪酸標準品對比,最后經(jīng)過NIST02庫檢索鑒定,分析得到脂肪酸的組成。以HepG2細胞模型測試SUL抗腫瘤能力,以不同濃度或不同處理時間的SUL作用于hepG2細胞,用MTT法、Hoechst33258對細胞殺傷能力進行檢測;通過活性氧(ROS)、總SOD酶活力和MDA含量檢測進行抗氧化能力的檢測;采用線粒體膜電位檢測法和FITC/PI雙染色法進行檢測,通過熒光倒置顯微鏡和流式細胞儀進行統(tǒng)計分析,從而斷定SUL有促進HepG2細胞抑制和凋亡的作用。MTBE法萃取分離的SUL,經(jīng)GC-MS分析得到,海膽油脂中飽和脂肪酸占比15.26%,單不飽和脂肪酸所占38.30%,多不飽和脂肪酸占比46.96%。HepG2細胞經(jīng)SUL誘導后細胞呈多種形態(tài),細胞漿收縮,核糖體、線粒體等細胞器聚集在一起,從而使得體積縮小,結(jié)構(gòu)更加緊密;染色質(zhì)逐漸聚集成新月狀,出現(xiàn)在核膜周邊,胞膜不斷分離出新的碎片,最終細胞變成多個形狀各異的由胞膜包裹的物體。MTT法檢測發(fā)現(xiàn)2.4 mg/mL,2.7 mg/mL,3.0 mg/mL,3.3 mg/mL濃度的SUL作用HepG2細胞均能抑制細胞增殖的作用。Hoechst33258染色法,對照組染色后發(fā)現(xiàn)胞核較大,細胞表面渾圓,光滑,胞核發(fā)散出清澈的藍色熒光,細胞核邊緣清楚。隨著加入的海膽油脂濃度的增大發(fā)生細胞的核破碎、細胞開始泯滅現(xiàn)象、脫壁死亡。且濃度越大此現(xiàn)象明顯。對于抗氧化的研究:檢測細胞內(nèi)的活性氧(ROS)、總SOD酶活力值、MDA含量3項指標,經(jīng)SPSS數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),延長SUL的濃度或處理時間后發(fā)現(xiàn),O_2~-的含量在增加,大量文獻證實活性氧可強化caspase的表達,從而指示腫瘤細胞發(fā)生凋亡,因此可以說明活性氧的增加也提高了誘導凋亡的能力。對于凋亡能力的檢測:首先選用了JC-1線粒體膜電位檢測分析法,延長加入海膽油脂后的培養(yǎng)時間,但不改變SUL濃度形況下發(fā)現(xiàn),細胞樣本中出現(xiàn)膜電位下降的細胞在增多,正常膜點位的細胞在減少。應用imagineJ對圖片熒光強度進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)熒光強度的比值(紅色/綠色)在降低,表明了細胞的凋亡程度在加深;其次應用了FITC/PI雙染色檢測法,不管是SUL的處理時間不同還是濃度的不同,根據(jù)細胞在圖像上的投影的趨勢,可以看出細胞由正常細胞向早期凋亡遷移,最終到達晚期晚期的行走軌跡,所以可以確定海膽油脂在一步步促其凋亡,隨著SUL處理時間和濃度的推移凋亡的程度也在加劇。實驗表明,這一發(fā)現(xiàn)表明SUL擁有抑制腫瘤細胞的能力;其次在探索抑制細胞途徑的道路上,SUL可以使細胞內(nèi)的活性氧的含量在增加,從而提升了細胞的凋亡能力;最后通過試劑盒檢測通過SUL的刺激使得凋亡現(xiàn)象確實存在,從而擁有抑制肝癌細胞的能力。從上述的實驗總結(jié)來看,海膽油脂為腫瘤的預防或緩解提供一條新的研究方向,因此具備成為一種新型功能性食品的潛質(zhì)。
【圖文】：

圖 3.1 脂肪酸組成 GC-MS 色譜圖Fig 3.1 GC-MS spectrum of fatty acids-MS 所得的光譜圖 3.1 可知，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對所檢測到的脂肪酸達各組分的所占比值，均列于表 3.1。海膽油脂中三大類脂肪酸包飽和脂肪酸比和多不飽和脂肪酸，其所占的比例分別為 15.26%而 EPA 脂肪酸占比 15.65%，DHA 脂肪酸占比 2.55%，已經(jīng)證實這瘤效果。其中對抗腫瘤活性存在潛在價值的 PUFA ω-3 和ω-6 各占此前文獻中記載著應用氯仿-甲醇法提取紫海膽黃中油脂的記錄，質(zhì)譜對脂肪酸組成進行定性定量分析，對結(jié)果進行分析后發(fā)現(xiàn)與99]。同時符合多數(shù)海洋生物油脂組成的規(guī)律，不飽和與多不飽和。表 3.1 海膽油脂脂肪酸組成Table 3.1 GC-MS spectrum of fatty acids脂肪酸 脂肪酸占比（%）8.86±0.21

第三章 結(jié)果與討論值法檢測名為四甲基偶氮唑鹽，這是一種化合物又是一種染料，以從外部得到氫原子，因為胞內(nèi)的線粒體中含有 SDH，反應，，產(chǎn)物為甲月替，物理性質(zhì)在水溶液中溶解度很低，此反應可以在活細胞內(nèi)進行，而死細胞沒有這個功能。使甲月替晶體溶解。所以根據(jù)這一特性，可以根據(jù)熒光活細胞的程度。雖然不能定量分析，可以根據(jù)酶標儀所檢算，便可以算出腫瘤細胞的活率，因此 MTT 法可以得到從而了解抗腫瘤材料對腫瘤細胞的殺傷能力。
【學位授予單位】：大連工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7;TS218

【參考文獻】

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本文編號：2684676