【摘要】：目的通過研究人黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和MEL624對B-Raf抑制劑達(dá)拉菲尼誘導(dǎo)耐藥性的機(jī)制,探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在黑素瘤自噬中的作用機(jī)制。首先研究B-Raf抑制劑達(dá)拉菲尼是否可以在兩種黑色素瘤細(xì)胞系中引起自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。其次,達(dá)拉菲尼誘導(dǎo)的自噬是否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控。最后,阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬是否可以增加達(dá)拉菲尼治療黑色素瘤細(xì)胞的功效。方法1、常規(guī)體外培養(yǎng)黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和MEL624,將黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和MEL624分別用濃度為0nM、10nM、100nM、250nM、500nM的達(dá)拉菲尼處理,24小時后用Western blot分別檢測兩種細(xì)胞系的自噬相關(guān)蛋白LC3I/II和P62以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白p-PERK和CHOP的表達(dá)情況。2、脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染黑素瘤細(xì)胞制備針對PERK的小干擾RNA(PERK-siRNA)和非目標(biāo)控制小干擾RNA(NTC-siRNA),針對PERK的小干擾RNA將PERK蛋白水平降低大約70%。用達(dá)拉菲尼(100nM)處理兩種細(xì)胞系的PERK-siRNA和NTC-siRNA,設(shè)置空白對照組,24小時后將細(xì)胞收集并通過Western blot檢測CHOP、IRE1α、P62、LC3I/II在兩種細(xì)胞系中的表達(dá)情況。3、用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸(4PBA 10nM)處理人黑色素瘤細(xì)胞A375和MEL624 1小時,隨后用達(dá)拉菲尼(100nM)處理24小時,同時設(shè)置空白對照組。收集細(xì)胞并通過CCK-8檢測細(xì)胞生存能力。4、在黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和MEL624中添加自噬抑制劑3-甲基腺苷(3-MA 2nM),同時設(shè)置空白對照組,然后用不同濃度的達(dá)拉菲尼處理兩種黑素瘤細(xì)胞系24小時。處理結(jié)束后,通過CCK-8檢測細(xì)胞生存能力。結(jié)果1、Western blot分別檢測黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和MEL624的LC3I/II和P62表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)隨達(dá)拉菲尼濃度的升高,LC3I/II的表達(dá)水平顯著增高,同時伴有P62表達(dá)水平顯著下降。用上述同樣方法,Western blot分別檢測兩種細(xì)胞系的p-PERK和CHOP表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)p-PERK和CHOP表達(dá)水平隨達(dá)拉菲尼濃度升高而表達(dá)水平增高。2、使用小干擾RNA將PERK基因敲低后,PERK蛋白表達(dá)水平降低大約70%。通過Western blot分別檢測發(fā)現(xiàn),PERK敲低后,CHOP、IRE1α表達(dá)量減少;同時,P62表達(dá)量增加,LC3II/I表達(dá)量減少。3、僅用達(dá)拉菲尼處理組與同時應(yīng)用4-苯基丁酸處理組相比細(xì)胞存活率更高。4、與3-甲基腺苷同時處理組相比,僅用達(dá)拉菲尼組細(xì)胞存活率更高。結(jié)論1、在黑素瘤細(xì)胞中,B-Raf抑制劑誘導(dǎo)的自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激呈劑量依賴性。2、在黑素瘤細(xì)胞中,抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可調(diào)節(jié)自噬水平。3、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可保護(hù)黑素瘤細(xì)胞免受B-Raf抑制劑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。4、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬可保護(hù)黑素瘤細(xì)胞免受B-Raf抑制劑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和MEL624分別用濃度為0nM、10nM、100nM、250nM、500nM的達(dá)拉菲尼處理24小時后，用Western blot分別檢測黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和MEL624的LCI/II和P62表達(dá)水平（圖1A和B），發(fā)現(xiàn)隨達(dá)拉菲尼濃度的升高LC3I/II的水平顯著增高，同時伴有顯著的P62水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。用上述同樣方法，Western blot分別檢測黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和MEL624的p-PERK和CHOP表達(dá)水平（圖2A和B）發(fā)現(xiàn)p-PERK和CHOP表達(dá)水平隨達(dá)拉菲尼濃度升高而表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A

同時伴有顯著的P62水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。用上述同樣方法，，Western blot分別檢測黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和MEL624的p-PERK和CHOP表達(dá)水平（圖2A和B）發(fā)現(xiàn)p-PERK和CHOP表達(dá)水平隨達(dá)拉菲尼濃度升高而表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 Mohamed Hassan;Denis Selimovic;Matthias Hannig;Youssef Haikel;Robert T Brodell;Mossaad Megahed;;Endoplasmic reticulum stress-mediated pathways to both apoptosis and autophagy: Significance for melanoma treatment[J];World Journal of Experimental Medicine;2015年04期

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本文編號：2670603