【摘要】：背景:在全世界范圍內(nèi),癌癥是一個比較突出公共衛(wèi)生問題,我國主要的惡性腫瘤主要是甲狀腺癌、胃癌、肺癌等其他十余種癌癥類疾病,在全部新發(fā)病例中約占75%。其中最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤是甲狀腺癌,每年發(fā)病率都在不斷的增長。甲狀腺癌的發(fā)病機制尚沒有完全闡明,例如碘的攝入、遺傳因素、放射線接觸、其他如性激素等都可能與甲狀腺癌的發(fā)生有關(guān),已經(jīng)嚴重影響到了人類健康安全,特別是對于女性來說,越來越成為影響健康的惡性腫瘤類疾病,能夠?qū)ふ业讲⒉扇》e極正確而有效的治療方案已成為當(dāng)務(wù)之急。甲狀腺癌有四種組織學(xué)類型,乳頭狀甲狀腺癌和濾泡性甲狀腺癌為分化型甲狀腺癌,約占甲狀腺惡性腫瘤90%以上。分化型甲狀腺癌一般可以治愈的,較為常見。未分化甲狀腺癌惡性程度最高,且死亡率極高。因此,對于甲狀腺癌的發(fā)病機制進行深入的探討和研究,有助于我們能夠?qū)τ诩谞钕侔┻M行更早的診斷,以及根據(jù)發(fā)病機制而開發(fā)的更加全面而有效的治療新方案,從而以期進一步改善甲狀腺癌患者的生活質(zhì)量,最終達到較穩(wěn)定和優(yōu)良的預(yù)后隨訪結(jié)果,降低甲狀腺癌類疾病的死亡率。對于大多數(shù)腫瘤來說基因的突變對于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要,基因與腫瘤的關(guān)系是通過細胞內(nèi)部的相關(guān)分子信號通路對于細胞產(chǎn)生作用,影響功能蛋白分子發(fā)生改變,使得細胞的增殖發(fā)生變化,細胞的生物學(xué)特性及形態(tài)學(xué)改變,最終產(chǎn)生腫瘤。研究表明mi R-21參與多種腫瘤的發(fā)生和生長。抑癌基因磷酸酶與張力蛋白同源物基因(PTEN)通過Akt去磷酸化抑制腫瘤,而PTEN是mi R-21的靶基因。許多學(xué)者進行的現(xiàn)代藥理實驗證據(jù)表明,天然藥物苦參堿具有常見的抗病毒、抗炎、抗心律失常等作用,同時具有很強的抑制腫瘤發(fā)生的作用,研究表明苦參堿可抑制腫瘤細胞的增生,臨床上苦參堿對肝癌、胃癌以及白血病都有良好的臨床治療效果,同時苦參堿成分的毒副作用弱,故經(jīng)過研究,在未來很有可能應(yīng)用其抗癌的良好作用,制成具有很好抗癌效果的植物活性藥物,可能是治療人甲狀腺癌乳頭狀細胞(Thyroid papillary carcinoma-1,TPC-1)的一種有前景的替代藥物。甲狀腺未分化癌(Anaplastic thyroid carcinoma,ATC)靶向治療最有效的藥物類別是紫杉醇(紫杉醇或多西紫杉醇)、蒽醌類、苯醌類和鉑類(順鉑或卡鉑)。天然產(chǎn)品苯醌類化合物--四氟對苯醌具有很好的抗腫瘤活性和毒性很低。作用機制涉及醌氧自由基的產(chǎn)生,參與重要的細胞過程的分子的甲基化、DNA等作用。目的:本研究旨在探討苦參堿對TPC-1細胞的治療作用及潛在分子機制。研究苦參堿對體外培養(yǎng)的TPC-1細胞增殖和細胞周期的影響,以及苦參堿對TPC-1細胞中mi R-21和靶基因PTEN/Akt通路表達的影響。探討四氟對苯醌在體內(nèi)和體外對ATC影響。為苦參堿和四氟對苯醌治療甲狀腺癌進一步研究,提供實驗室依據(jù)和理論基礎(chǔ),探索苦參堿和四氟對苯醌治療甲狀腺癌的應(yīng)用前景,為治療甲狀腺癌的藥物開發(fā)提供新的研究思路。方法:(1)MTT法檢測苦參堿對TPC-1細胞生存率的影響。(2)q RT-PCR檢測苦參堿作用TPC-1細胞,micro RNA-21基因表達變化。(3)分別轉(zhuǎn)染micro RNA-21 mimics質(zhì)粒和micro RNA-21 inhibitor質(zhì)粒,Annexin V-PI檢測細胞凋亡變化;(4)Western blot方法檢測線粒體凋亡相關(guān)蛋白PTEN蛋白、Akt蛋白的變化。(5)用MTT法分析了HOTHC和ATC細胞系的生長情況。(6)Western blot對蛋白帶進行定量及DAPI染色細胞的核分裂分析。(7)分析HOTHC細胞的小管形成趨勢及測定HOTHC細胞遷移。(8)裸鼠模型實驗測定腫瘤體積和重量,以測定腫瘤生長抑制率。結(jié)果:(1)MTT法測定苦參堿在濃度和時間上抑制TPC-1細胞的生長,最高可達95.8%(20 mg/ml的苦參堿),其IC50為3.54 mg/ml,48 h。(2)用FITC-A/PI雙染色和流式細胞術(shù)檢測TPC-1甲狀腺癌細胞凋亡�？鄥A誘導(dǎo)TPC-1細胞凋亡顯著。發(fā)現(xiàn)M0對照組在G1期51.36±2.07%,在S期23.37±3.25%和G2/M期18.49±2.46%。與苦參堿TPC-1細胞治療后10 mg/ml 48h,在G1期細胞比例增加到74.49±3.65%,在S期下降到2.42±1.63%。在G2/M相中,未觀察到細胞百分比的顯著變化。這些結(jié)果表明,在甲狀腺癌細胞的G1/S期,苦參堿誘導(dǎo)細胞周期阻滯。(3)mi R-21的水平是由實時qPCR測定,TPC-1細胞用苦參堿0、2、5mg/ml(M0,M2和M5)處理后48 h。苦參堿處理的TPC-1細胞,mi R-21明顯降低。PTEN結(jié)果上調(diào)M5/M0增加到1.66倍,M2/M0增加到1.21倍。Akt水平降低M5/M0為0.34倍和M2/M0為0.61倍。實驗表明,使用苦參堿治療的TPC-1細胞的mi R-21水平被下調(diào),隨后,其目標PTEN在m RNA和蛋白水平均升高,Akt水平降低。另一方面,mi R-21模擬序列被轉(zhuǎn)染到TPC-1細胞中,發(fā)現(xiàn)mi R-21的過度表達下調(diào)了PTEN蛋白水平。這些結(jié)果表明,苦參堿可以調(diào)節(jié)mi R-21來改善PTEN抑制TPC-1甲狀腺癌細胞。(4)Western blotting檢測PTEN蛋白和磷酸化Akt(p Akt)蛋白水平。與M0對照相比,PTEN在苦參堿上顯著上調(diào)(M5/M0 1.64倍,M2/M0 1.21倍)。p Akt的水平被下調(diào)(M2/M0為0.61倍,M5/M0為0.24倍)。mi R-21 mimic顯著降低了PTEN蛋白(與M0 blot的比值),并將p Akt增加到1.24倍(比M0 blot值)。這些結(jié)果闡明了苦參堿調(diào)控mi R-21/PTEN/Akt通路誘導(dǎo)TPC-1細胞凋亡和周期阻滯。(5)MTT實驗結(jié)果表明,在四氟對苯醌治療48小時內(nèi),HOTHC和ATC細胞系的生長顯著下降。使細胞的生長從98%減少到17%,細胞生長速率分別為96%和21%。(6)HOTHC細胞凋亡。Western blot分析顯示在HOTHC細胞系中Bcl-2的表達明顯減少。DAPI染色結(jié)果顯示,在四氟對苯醌治療HOTHC細胞中,DNA的分裂和核細胞凋亡的存在。(7)用四氟對苯醌對HOTHC細胞的治療后,導(dǎo)致了對低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達的抑制。(8)在使用四氟對苯醌的治療中,HOTHC細胞的血管生成能力和遷移潛力均受到抑制。(9)四氟對苯醌治療在小鼠異種移植模型體內(nèi)抑制腫瘤生長。結(jié)論:(1)苦參堿抑制TPC-1人甲狀腺癌乳頭狀細胞增殖,誘導(dǎo)細胞凋亡和周期阻滯;(2)苦參堿下調(diào)TPC-1人甲狀腺癌乳頭狀細胞中mi R-21表達量;誘導(dǎo)PTEN上調(diào),p Akt信號下調(diào);(3)mi R-21/PTEN/Akt通路可能是苦參堿抑制TPC-1甲狀腺癌細胞的機制之一。(4)在四氟對苯醌治療HOTHC和ATC細胞系的生長顯著下降,B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)的表達明顯減少,Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和細胞凋亡的標志蛋白PARP降解產(chǎn)物(cleaved-PARP)的表達細胞增加。(5)對HOTHC細胞的治療導(dǎo)致了對HIF-1和VEGF表達的抑制,HOTHC細胞的血管生成能力和遷移潛力均受到抑制。(6)四氟對苯醌治療裸鼠腫瘤體積和重量顯著下降。(7)苦參堿和四氟對苯醌可以成為治療甲狀腺癌的有效替代藥物。
【圖文】：

圖 1：MAPK 和 PI3K- Akt -MTR 通路在甲狀腺癌中的遺傳改變和治療靶點。右側(cè)顯示MAPK 信號通路，左側(cè)顯示 PI3K- Akt -mTOR 通路。MAPK 通路中的突變包括 RT-PTC重排、RAS 突變和 BRAF 突變。PI3K 通路中常見的遺傳改變包括 RAS 突變、PTEN 突變或缺失，PIK3CA 突變或擴增，Akt1 突變[91]。在許多不同類型的腫瘤組織、移植瘤、腫瘤細胞系和多種進展期腫瘤組織（ 如腦腫瘤、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、膀胱癌、甲狀腺癌及非小細胞肺癌）中存在著不同程度的突變或丟失的PTEN 基因；此種改變可作為脂質(zhì)磷酸酶，，負性調(diào)控 P13K-Akt 通路，促進細胞增殖和凋亡；也可作為蛋白磷酸脂酶，抑制 MAPK 信號通路[92]。PTEN 作為抑癌基因之一，其發(fā)生突變或者缺失導(dǎo)致PI3K-Akt 信號通路激活，在絕大多數(shù)的腫瘤發(fā)生過程中，扮演著重

第 2 章 苦參堿對分化型甲狀腺癌靶向治療應(yīng)用研究結(jié)果1 苦參堿對 TPC-1 細胞增殖的影響MTT 法測定細胞在 0、1、2、5、10、20 mg/ml、24h、48h、7情況下，對甲狀腺癌細胞 TPC-1 的生長情況進行測定�？鄥A TPC-1 細胞在濃度和時間上的生長，其 IC50 為 3.54 mg/ml, 48 1）。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R736.1

【參考文獻】

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本文編號：2665945