【摘要】：研究背景:腫瘤是細(xì)胞分裂與細(xì)胞死亡失衡的一類疾病。在世界范圍內(nèi),肺癌已成為是腫瘤死亡的首要原因。而在我國(guó)城市人口中,肺癌患者的死亡已上升為占腫瘤死亡原因第一位~([1])。在確診肺癌的患者中只有16%生存期超過(guò)五年或以上。按照病理類型分類,肺癌中的85%以上為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)~([2])。目前,手術(shù)仍是非小細(xì)胞肺癌的首選的治療方法,然而對(duì)于不適合手術(shù)的晚期患者或需要進(jìn)行術(shù)后治療的患者來(lái)說(shuō),化療仍是最主要的治療手段。雖然目前用于化療的藥物及治療方案多樣,也在一定程度上可以改善晚期肺癌的患者的預(yù)后,但由于不可避免的藥物毒性及逐漸出現(xiàn)的藥物耐藥,仍然使大多數(shù)患者最終仍然出現(xiàn)治療失敗的結(jié)果。腫瘤藥物的化學(xué)耐藥已經(jīng)成為是化學(xué)治療抗癌失敗的主要原因。因此,進(jìn)一步延長(zhǎng)NSCLC患者生存期,緩解腫瘤患者臨床癥狀成為了目前臨床治療的主要目的~([3,4])。吉西他濱與紫杉醇均為臨床上療效較佳的化療藥物。吉西他濱是核苷類藥物,其作用機(jī)理是通過(guò)殺傷S期腫瘤細(xì)胞,并且阻斷增殖細(xì)胞由G1向S期轉(zhuǎn)化進(jìn)展~([5])。吉西他濱具有抑制DNA合成作用,從而殺傷腫瘤細(xì)胞;同時(shí)還可提高腫瘤細(xì)胞對(duì)其他藥物的敏感性。紫杉醇的作用機(jī)制主要是通過(guò)促進(jìn)微管蛋白二聚體的組合并阻止其解聚而達(dá)到穩(wěn)定微管的作用,從而抑制了細(xì)胞有絲分裂期至關(guān)重要的微管的正常動(dòng)態(tài)重組,將細(xì)胞周期阻斷于G2/M期,阻礙腫瘤細(xì)胞復(fù)制,使癌細(xì)胞無(wú)法繼續(xù)分裂而死亡。同時(shí)紫杉醇還有誘發(fā)癌細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)人體機(jī)能的作用~([6])。然而,耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)導(dǎo)致以吉西他濱和紫杉醇這兩種藥物為主的治療不能取得較佳的臨床療效,致使肺癌治療的困難加大。Notch信號(hào)通路參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡、黏附及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過(guò)程,其異�？赡軐�(dǎo)致腫瘤生成~([7])。異�；罨腘otch通路可能通過(guò)其下游的蛋白調(diào)控著腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲~([8])。有研究表明,Notch通路的異常活化與卵巢癌耐藥性有關(guān)。Notch3活化的卵巢癌細(xì)胞對(duì)鉑依賴的化療藥物能產(chǎn)生耐藥性~([9])。我們既往研究也表明,Notch信號(hào)通路在非小細(xì)胞肺癌預(yù)后中存在作用~([10])。針對(duì)患者對(duì)吉西他濱和紫杉醇的耐藥性導(dǎo)致臨床效果不佳的問(wèn)題,為探尋解決辦法,我們從Notch信號(hào)通路著手研究。探討該信號(hào)通路在吉西他濱和紫杉醇的耐藥中的作用,為非小細(xì)胞肺癌耐藥尋找新的治療方案。研究目的:(1)探討Notch信號(hào)通路在耐藥非小細(xì)胞肺癌治療中作用:檢測(cè)Notch信號(hào)通路阻斷劑GSI-IX干預(yù)后,紫杉醇和吉西他濱對(duì)H1299細(xì)胞和A549細(xì)胞克隆形成的影響。(2)檢測(cè)紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞株中Notch3蛋白的表達(dá)情況和變化。分析Notch信號(hào)通路在肺癌耐藥中的作用。(3)研究比較對(duì)紫杉醇和吉西他濱對(duì)各自耐藥細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用是否存在交叉敏感性。(4)分析Notch信號(hào)通路阻斷劑GSI-IX對(duì)耐藥肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡的影響,從而探討GSI-IX能否通過(guò)激活凋亡途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而提高化療藥物紫杉醇和吉西他濱在耐藥細(xì)胞中的敏感性。實(shí)驗(yàn)方法:(1)細(xì)胞培養(yǎng):本研究培養(yǎng)H1299和A549細(xì)胞,并分別用紫杉醇和吉西他濱誘導(dǎo)出相應(yīng)的耐藥細(xì)胞株。(2)用Western blot方法分別檢測(cè)H1299和A549細(xì)胞及相應(yīng)的紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞中Notch3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況。(3)采用MTT方法檢測(cè)GSI-IX單獨(dú)干預(yù)和協(xié)同紫杉醇、吉西他濱對(duì)相應(yīng)的耐藥H1299和A549細(xì)胞增殖能力的影響。(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GSI-IX單獨(dú)作用和協(xié)同作用紫杉醇、吉西他濱對(duì)相應(yīng)耐藥H1299和A549細(xì)胞凋亡作用的影響。結(jié)果:(1)分析比較GSI-IX、吉西他濱、紫杉醇單獨(dú)和聯(lián)合作用于H1299細(xì)胞和A549細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞克隆數(shù)的影響。結(jié)果顯示:GSI-IX組的細(xì)胞克隆數(shù)減少,其作用與單純吉西他濱、單純紫杉醇作用比較,作用相當(dāng)。并且GSI-IX聯(lián)合吉西他濱組對(duì)兩種細(xì)胞克隆數(shù)減少的影響作用最大。提示GSI-IX可以提高吉西他濱對(duì)腫瘤細(xì)胞的化療敏感性。(2)檢測(cè)吉西他濱和紫杉醇耐藥細(xì)胞株中的Notch3蛋白的表達(dá)情況顯示:耐藥細(xì)胞中的Notch3蛋白明顯比非耐藥細(xì)胞中的Notch3蛋白增加。比較GSI-IX加入4組耐藥細(xì)胞后Notch3蛋白表達(dá)水平與單獨(dú)的耐藥細(xì)胞株中的Notch3蛋白表達(dá)水平,前者較后者明顯減少。說(shuō)明Notch3信號(hào)通路與腫瘤耐藥有關(guān),可能參與了腫瘤耐藥的進(jìn)程。(3)檢測(cè)吉西他濱和紫杉醇在對(duì)4組耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果顯示吉西他濱作用于紫杉醇耐藥的2組細(xì)胞,其對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用比作用于吉西他濱耐藥的2組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)。同時(shí)紫杉醇對(duì)吉西他濱耐藥的2組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)于紫杉醇耐藥的2組細(xì)胞。說(shuō)明紫杉醇和吉西他濱不存在交叉耐藥現(xiàn)象,反而交叉使用可以提高化療敏感性。(4)檢測(cè)GSI-IX對(duì)4種耐藥細(xì)胞增殖力的影響。結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,GSI-IX組及GSI-IX聯(lián)合吉西他濱或紫杉醇組明顯抑制了細(xì)胞的增殖;與單純吉西他濱或紫杉醇組相比,GSI-IX提高了吉西他濱或紫杉醇對(duì)4種耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。并且,不同濃度的GSI-IX對(duì)耐藥細(xì)胞的抑制作用不同,20um濃度,抑制作用最強(qiáng)。表明GSI-IX可提高了吉西他濱或紫杉醇的藥物敏感性。(5)檢測(cè)GSI-IX作用于4種耐藥細(xì)胞后,增加了細(xì)胞的凋亡,同時(shí)檢測(cè)Bcl-2和Bax的表達(dá)水平,結(jié)果顯示隨著GSI-IX作用濃度的增加,Bcl-2表達(dá)下調(diào)伴隨Bax表達(dá)水平上調(diào),據(jù)此,推測(cè)GSI-IX調(diào)控凋亡蛋白的表達(dá),從而影響吉西他濱和紫杉醇對(duì)耐藥細(xì)胞的抗腫瘤作用。結(jié)論:(1)通過(guò)比較GSI-IX和紫杉醇、吉西他濱對(duì)肺癌細(xì)胞的作用,可以得出GSI-IX有如同化療藥物吉西他濱、紫杉醇類似的抗腫瘤作用。GSI-IX聯(lián)合吉西他濱可作為肺癌化療的新的治療方案。(2)GSI-IX能降低耐藥細(xì)胞中Notch3蛋白表達(dá),且GSI-IX作用于耐藥細(xì)胞可提高不同耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,同時(shí)能提高吉西他濱或紫杉醇的抗腫瘤作用。我們可以此推論Notch3信號(hào)通路參與腫瘤耐藥,阻斷Notch3信號(hào)通路可提高耐藥腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性。(3)GSI-IX對(duì)耐藥細(xì)胞株可增加細(xì)胞的凋亡率,相關(guān)凋亡蛋白Bcl-2和Bax也呈現(xiàn)相應(yīng)變化。可以推測(cè)GSI-IX通過(guò)調(diào)控凋亡途徑,從而改變耐藥H1299細(xì)胞和A549細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗。表明GSI-IX有可能通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到治療非小細(xì)胞肺癌目的。
【圖文】：

安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文同時(shí)單純 GSI-IX 組的細(xì)胞克隆減少率可堪比單純紫杉醇組。并且在這六組中，紫杉醇+ GSI-IX 組對(duì)細(xì)胞克隆數(shù)量減少的影響最大，其與單純紫杉醇組相比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，，（見(jiàn)圖 1）。這提示 GSI-IX 除了可通過(guò)抑制細(xì)胞克隆途徑抑制腫瘤生長(zhǎng)，還可以提高紫杉醇對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用的敏感性。

安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文對(duì)照組、單純 GSI-IX 組、單純吉西他濱組和吉西他濱+DMSO 組和吉西他濱+GSI-IX 組。我們發(fā)現(xiàn)加入吉西他濱的三組對(duì)兩種細(xì)胞均不同程度的減少了細(xì)胞克隆數(shù)量，同時(shí)單純 GSI-IX 組的細(xì)胞克隆減少率可堪比單純吉西他濱組。并且在這六組中，吉西他濱+ GSI-IX 組對(duì)細(xì)胞克隆數(shù)量減少的影響最大，其與單純吉西他濱組相比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，（見(jiàn)圖 2）。這提示 GSI-IX 除了可通過(guò)抑制細(xì)胞克隆途徑抑制腫瘤生長(zhǎng)，還可以提高吉西他濱對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用的敏感性。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：2665346