【摘要】：結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是全球第三大常見的惡性腫瘤,全球每年新發(fā)病例數(shù)約為140萬例,其發(fā)病率在男性及女性中均處于惡性實體腫瘤的第3位,癌癥相關死亡原因已分別上升至第2位和第3位[1]。近年來,結(jié)直腸癌的發(fā)病率不斷上升,而我國的上升速度是國際平均增速(2%)的2倍,尤其在上海等東南沿海發(fā)達城市,發(fā)病率達到實體腫瘤的第二位,嚴重威脅著人類的健康和生活質(zhì)量[2,3]。腸癌發(fā)病隱匿,相當一部分患者在首次就診確診時已經(jīng)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[4]。目前對于晚期結(jié)直腸癌患者而言,姑息手術、新輔助放化療以及靶向藥物的應用是主要治療手段,但又由于患者間個體差異和耐藥性的出現(xiàn)等,晚期結(jié)直腸癌的療效和預后不夠理想[5]。近年來,腫瘤的免疫治療越來越受到關注。2012年,被Science雜志評為未來值得關注的六大領域之一[6];2013年,又被Science雜志評為“年度十大進展之首”[7];并連續(xù)成為2015、2016年全球腫瘤研究頂級盛會——美國臨床腫瘤學會(ASCO)熱點中的焦點,當仁不讓的成為了會議的主旋律[8,9]。Topalian博士因其在PD-1和PD-L1免疫治療研究的突出貢獻,被授予2015年“David A.Karnofsky Memorial Award”(ASCO最重要的獎項)。目前,大量的基礎和臨床研究已經(jīng)聚焦腫瘤免疫治療。結(jié)直腸癌患者也從免疫治療中看到了希望,尤其是錯配修復基因缺陷(Mismatch repair deficiency,dMMR)的CRC患者,對PD-1單抗藥物的敏感性比微衛(wèi)星穩(wěn)定性(Microsatellite stability,MSS)患者顯著提高[10]。微衛(wèi)星不穩(wěn)定(Microsatellite instability,MSI)是結(jié)直腸癌發(fā)病的重要原因之一。它是指MSH2、MSH6、MLH1、PMS1和PMS2等錯配修復基因發(fā)生突變導致DNA重復序列(微衛(wèi)星)的增加或缺失,進而引起腫瘤的發(fā)生[11,12]。由于微衛(wèi)星序列突變累積,蛋白質(zhì)翻譯過程中發(fā)生框移突變,導致腫瘤細胞產(chǎn)生了大量異常的多肽片段,這些片段更容易被免疫系統(tǒng)所識別,激發(fā)機體的抗腫瘤免疫應答反應[13],這也是微衛(wèi)星不穩(wěn)定患者對PD-1單抗敏感的主要原因。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性在散發(fā)性結(jié)直腸癌中的發(fā)生頻率大約僅為15%[14]。但是對于大部分微衛(wèi)星穩(wěn)定性的結(jié)直腸癌患者而言,PD-1單抗難以取得顯著的療效,如何提高這部分患者的療效成為結(jié)直腸癌治療的重大問題。目前,腫瘤免疫療法聯(lián)合治療的應用已經(jīng)成為全球科學家的共識,綜合治療依舊是癌癥的理想治療模式。在與腫瘤抗爭的幾百年來,人們已經(jīng)意識到單憑一種療法是無法攻克腫瘤這一頑疾的。只有通過不同機制的抗腫瘤協(xié)同治療,如傳統(tǒng)放化療與免疫療法聯(lián)用、治療性疫苗與免疫檢查點抑制劑聯(lián)用、CAR-T療法與免疫檢查點抑制劑聯(lián)用、靶向藥物與免疫療法聯(lián)用,以及腫瘤免疫療法與基因療法聯(lián)用等[15-19]。在傳統(tǒng)的手術、放療以及化療使腫瘤細胞負荷明顯降低,機體的免疫功能得以改善的基礎上,通過聯(lián)合適當?shù)哪[瘤免疫治療,可以清除微小的殘留病灶或抑制殘留癌癥細胞增殖,改善癌癥患者的預后,延長生存時間,提高生活質(zhì)量,從而達到治愈癌癥的目的。深入理解腫瘤和免疫系統(tǒng)之間的相互作用,利用各種免疫治療手段的優(yōu)勢,互相協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用,優(yōu)化腫瘤治療方案成為當前研究的熱點。地西他濱(5-aza-2'-deoxynucleoside,DAC)是一種腺苷類似物,通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,降低DNA的甲基化水平,從而抑制腫瘤細胞的增殖,是作用能力較強的DNA甲基化特異性抑制劑,已經(jīng)廣泛應用于骨髓增生異常綜合征、急性白血病的治療,作為甲基化抑制劑也在實體瘤中被廣泛研究。研究證明,低劑量DAC不僅可以明顯誘導和提高腫瘤抗原的表達,如NY-ESO-1、MAGE-A3/6等,還能提高CD80、MHC-I類分子等免疫標志物的表達[20,21],進而增加腫瘤局部免疫細胞的浸潤,為免疫檢查點抑制劑、治療性疫苗、過繼性細胞治療等免疫療法提供了更加適合的免疫微環(huán)境。本課題旨在研究低劑量DAC對腫瘤生物學特征、免疫原性的影響以及對腫瘤微環(huán)境的作用及其機制,探討其與PD-1單抗、NY-ESO-1特異性TCR-T細胞等免疫治療的協(xié)同效應,為MSS結(jié)直腸癌的臨床治療提供新的策略和科學依據(jù)。本研究主要分為三個部分:第一部分:低劑量地西他濱對腫瘤的表觀修飾作用研究DNA甲基化是一種不改變基因堿基序列的可逆的基因修飾,其甲基化水平與基因的“開放”狀態(tài)密切相關�；诘蛣┝緿AC的去甲基化作用,我們對微衛(wèi)星穩(wěn)定的小鼠腸癌細胞系CT26[22]進行了DAC處理,提取了基因組DNA和總RNA,利用全基因組甲基化測序(WGBS)和全轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)對腫瘤細胞的特征改變進行了檢測和分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CT26細胞經(jīng)過DAC處理后,基因組總體甲基化水平顯著下調(diào)。其中,抗原加工和遞呈相關基因、細胞因子相關基因和趨化因子以及STAT基因、免疫應答相關基因、MAPK信號傳導途徑基因和PI3K-AKT信號傳導途徑相關基因中啟動子區(qū)域的甲基化水平顯著下調(diào)。全轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示,CT26細胞的表達譜明顯改變,發(fā)現(xiàn)大量差異表達的功能相關基因,包括180個上調(diào)的基因和139個下調(diào)的基因。我們著重關注了WGBS結(jié)果中甲基化水平發(fā)生變化的mRNA的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),抗原加工和遞呈相關基因、細胞因子相關基因、趨化因子相關基因,STAT基因,免疫應答相關基因,MAPK信號傳導途徑基因和PI3K-AKT信號傳導途徑基因的表達發(fā)生明顯改變。值得注意的是,抗原加工和遞呈相關基因顯著上調(diào)。這表明基因啟動子區(qū)的高甲基化水平可以抑制基因的表達,當甲基化水平被下調(diào)時,基因表達重新被激活,表達水平上升,即上述基因的表達水平與其啟動子區(qū)甲基化水平具有相關性。腫瘤細胞在經(jīng)過DAC處理后,基因組甲基化水平明顯下降,細胞表達譜發(fā)生了明顯變化,其免疫原性得到提高。同時,我們收集了臨床患者的新鮮腫瘤組織,在重度免疫缺陷NCG小鼠上構(gòu)建了CRC的PDX模型,并根據(jù)美國國立癌癥研究所Boland等[23]的標準進行了微衛(wèi)星狀態(tài)的鑒定。我們選取了MSS的PDX模型予以DAC處理,提取了腫瘤組織的基因組DNA和總RNA,也進行了WGBS和RNA-seq檢測和分析。我們發(fā)現(xiàn)了與CT26細胞經(jīng)DAC處理后類似的現(xiàn)象:PDX模型的腫瘤細胞經(jīng)過DAC處理后,其甲基化水平顯著下調(diào)。其中,抗原加工和遞呈相關基因,免疫相關基因和蛋白質(zhì)修飾基因中啟動子區(qū)域的甲基化水平被下調(diào)。表達譜也發(fā)生了顯著變化,其中有89個基因顯著上調(diào),50個基因顯著下調(diào)。上調(diào)基因主要是抗原加工和遞呈基因,免疫相關基因和蛋白修飾基因,與WGBS結(jié)果顯示的低甲基化水平具有一致性。這說明低劑量DAC改變了PDX腫瘤的特性,提高了其免疫原性。為了探究DAC對不同微衛(wèi)星狀態(tài)的CRC細胞的影響,我們選取了兩株MSI細胞HCT116、LOVO和兩株MSS細胞HT29、SW480,用0μM、0.1μM、1μM、10μM等不同濃度的DAC進行處理,在處理后的不同時間點(第1天,第3天,第7天)收集了腫瘤細胞的總RNA、DNA和蛋白質(zhì),通過qPCR、Western Blot等技術檢測了細胞中NY-ESO-1抗原mRNA和蛋白的表達水平,并通過甲基化測序檢測了基因組DNA中NY-ESO-1啟動子區(qū)的甲基化情況。結(jié)果顯示,低劑量DAC可誘導或提高CRC細胞系中NY-ESO-1基因的表達。在MSS細胞系中,HT29和SW480的NY-ESO-1表達需要更低濃度DAC的誘導,誘導所需的時間也更短,NY-ESO-1表達水平比未處理的細胞平均升高20-30倍,顯著的高于MSI細胞中的5-10倍。而NY-ESO-1啟動子區(qū)的甲基化水平與其基因表達水平也密切相關,甲基化水平越低,其表達水平越高。通過第一部分的研究,我們證實了小鼠微衛(wèi)星穩(wěn)定性腸癌細胞系CT26細胞經(jīng)過低劑量DAC處理后,其基因組甲基化水平明顯下調(diào),重新激活或上調(diào)了大量功能基因的表達,改變了腫瘤的免疫學特征,提高了其免疫原性。在PDX腫瘤模型中,這一現(xiàn)象得到了再次驗證。該部分研究結(jié)果為下一步的研究提供了理論依據(jù)。第二部分:低劑量地西他濱對腫瘤微環(huán)境的作用研究影響免疫治療在實體瘤中療效的主要問題是腫瘤抑制性的免疫微環(huán)境。如何打破和重塑腫瘤微環(huán)境,激發(fā)機體的抗腫瘤免疫應答是實體瘤治療取得突破的關鍵。腫瘤微環(huán)境中的免疫微環(huán)境決定了免疫治療的有效性[24-27],而免疫相關分子的表達及細胞的浸潤是腫瘤微環(huán)境的關鍵組成。第一部分中,我們已經(jīng)證實了低劑量DAC可以改變腫瘤的特征,提高其免疫原性。我們又構(gòu)建了CT26荷瘤小鼠模型,給予荷瘤小鼠DAC處理,同時PBS和Cytidine(胞嘧啶類似物)作為對照,收集了DAC處理后不同時間點(處理前,處理后1天,處理后3天,處理后7天,處理后14天)的腫瘤組織,通過免疫組化檢測腫瘤微環(huán)境中的淋巴細胞浸潤情況和細胞狀態(tài)等,進一步探究了低劑量DAC對腫瘤微環(huán)境的影響。我們發(fā)現(xiàn),在低劑量DAC處理后,隨著時間的延長,浸潤到腫瘤局部的T淋巴細胞越來越多,7-14天后達到峰值。進一步檢測腫瘤微環(huán)境中的CD3~+T細胞、CD4~+T細胞、CD8~+T細胞的浸潤,分泌IFN-γ細胞因子的細胞數(shù)量以及PD-1的表達情況,發(fā)現(xiàn)DAC處理組相比于對照組有更多的T淋巴細胞浸潤,包括CD4~+T淋巴細胞和CD8~+T淋巴細胞;且分泌IFN-γ細胞因子的細胞數(shù)量顯著高于PBS組和Cytidine組。值得注意的是,我們發(fā)現(xiàn)大部分浸潤的T淋巴細胞均為PD-1陽性,這表明DAC對于TME的影響作用可能通過PD-1/PD-L1通路被抑制。通過第二部分的研究,我們發(fā)現(xiàn)了低劑量DAC可以重塑腫瘤微環(huán)境,召募更多的T淋巴細胞,包括CD4~+T細胞、CD8~+T細胞,浸潤到腫瘤局部,且大部分細胞分泌高水平的IFN-γ,但是這些細胞大部分是PD-1陽性的,其功能可能通過PD-1/PD-L1通路被抑制。第三部分:地西他濱為基礎的協(xié)同免疫治療策略的研究一、地西他濱與PD-1抑制劑協(xié)同性治療策略研究研究證明,PD-1單抗對于MSS腫瘤基本上是無效的[10]。通過前面兩部分的研究,我們發(fā)現(xiàn)低劑量DAC可以改變腫瘤的免疫學特征,提高其免疫原性,且能夠召募大量的T淋巴細胞浸潤到腫瘤局部,從而有可能對腫瘤微環(huán)境進行重塑。但是這部分浸潤到腫瘤局部的T淋巴細胞大部分為PD-1陽性,因此我們緊接著聯(lián)合應用PD-1單抗,探討協(xié)同效應提高療效的可能性。在這一部分中,我們首先選取CT-26小鼠腸癌細胞構(gòu)建了MSS的荷瘤小鼠模型,給予了DAC+PD-1單抗聯(lián)合用藥的治療方法,將PBS、PD-1單抗單藥、DAC單藥治療作為對照組,探討了DAC與PD-1單抗協(xié)同治療的療效。結(jié)果顯示,DAC+PD-1單抗組與PD-1單抗組、DAC單藥組相比,對腫瘤生長具有明顯的抑制作用,延長小鼠生存期的效應也更加顯著。結(jié)果表明,DAC的預處理聯(lián)合PD-1單抗的治療方法,能夠明顯抑制MSS荷瘤小鼠的腫瘤生長和延長其生存期,結(jié)合第一部分的體外細胞學實驗,其機制可能是由于DAC對腫瘤細胞的效應而招募到腫瘤局部的PD-1陽性的T淋巴細胞被PD-1單抗解除抑制,從而在腫瘤局部發(fā)揮了抗腫瘤效應。二、地西他濱與TCR-T細胞治療協(xié)同性治療策略研究在第一部分中,我們證實了DAC可以誘導和提高MSS腫瘤細胞NY-ESO-1抗原的表達,而腫瘤抗原的表達直接決定著特異性細胞免疫治療的效應。因此,我們探索了將DAC與NY-ESO-1特異性的T細胞進行協(xié)同治療的療效。首先,我們從文獻和數(shù)據(jù)庫中獲得了NY-ESO-1_(157-165)(SLLMWITQC)特異性TCRα/β基因序列,將α鏈95-96位的TS突變?yōu)長Y,以提高其抗原特異性殺傷功能[28,29];另外,將α鏈的Thr~(48)和β鏈的Ser~(57)突變成Cys,有利于形成二硫鍵,提高其與外源基因的匹配成功率[30]。TCRα/β鏈基因之間用具有“self-cleavege”功能的P2A連接,使翻譯出來的產(chǎn)物能夠被剪切成α/β鏈,從而更好地進行匹配[30,31]。優(yōu)化后的序列克隆入慢病毒過表達載體,利用HEK-293T細胞包裝慢病毒。隨后,我們又從人的外周血中分離出淋巴細胞,經(jīng)過流式檢測HLA-A2表型,篩選出HLA-A2強陽性的淋巴細胞經(jīng)CD3~+/CD28~+Dynabeads進行分選和活化。利用包裝好的慢病毒轉(zhuǎn)染活化的CD3~+/CD28~+/HLA-A2~+淋巴細胞,流式檢測其TCR表達情況,MHC-Tetramer檢測其與抗原的結(jié)合能力。結(jié)果顯示,特異性TCR的轉(zhuǎn)染效率為56%,四聚體檢測其特異性結(jié)合的陽性率為15%,說明我們成功制備了NY-ESO-1特異性TCR-T細胞。為了在體外檢測所構(gòu)建的TCR-T細胞能否識別NY-ESO-1抗原并分泌細胞因子,我們將HLA-A2特異性的NY-ESO-1_(157-165)(SLLMWITQC)多肽和無關同源多肽OVA_(257-264)(SIINFEKL)負載到T2細胞上作為靶細胞,所構(gòu)建的TCR-T細胞與負載抗原的T2細胞共培養(yǎng)24 h,ELISPOT檢測培養(yǎng)上清中IFN-γ的釋放,結(jié)果顯示,與負載NY-ESO-1_(157-165)的T2細胞共培養(yǎng)的TCR-T細胞能夠高分泌IFN-γ,并且明顯高于負載無關同源多肽的T2細胞所共培養(yǎng)的TCR-T細胞。以上結(jié)果表明所構(gòu)建的TCR-T細胞可以特異性的識別T2細胞上的NY-ESO-1并誘導分泌細胞因子IFN-γ。隨后,我們通過體外實驗進一步驗證了所構(gòu)建TCR-T細胞的殺傷效應。選取了HLA-A2和NY-ESO-1不同表型的腫瘤細胞作為靶細胞:LOVO(NY-ESO-1~-/HLA-A2~-),MGC 803(NY-ESO-1~+/HLA-A2~-),SW480(NY-ESO-1~±/HLA-A2~+),A375細胞(NY-ESO-1~(++)/HLA-A2~+)做陽性對照,以及根據(jù)第一部分WB結(jié)果,經(jīng)過1μM DAC誘導的HCT116(NY-ESO-1~+/HLA-A2~+)。將靶細胞與所構(gòu)建的TCR-T細胞共培養(yǎng),LDH Assay檢測TCR-T的殺傷效應,ELISPOT檢測TCR-T的IFN-γ的分泌。結(jié)果顯示,A375、HCT116與TCR-T細胞共培養(yǎng)的孔中可見大量斑點形成,數(shù)量遠遠高于LOVO、MGC 803、SW480與TCR-T共培養(yǎng)的孔,即與A375、HCT116共培養(yǎng)的TCR-T細胞釋放了大量的IFN-γ。相應地,A375、HCT116與TCR-T細胞共培養(yǎng)的孔中檢測到大量LDH的釋放,其含量遠高于LOVO、MGC 803、SW480與TCR-T共培養(yǎng)的孔,即TCR-T細胞對A375、HCT116細胞產(chǎn)生了較好的殺傷效應。體外實驗說明,TCR-T細胞對NY-ESO-1~+/HLA-A2~+細胞具有特異性的殺傷作用,對于NY-ESO-1或HLA-A2單陽性或雙陰性的細胞沒有殺傷效應。體內(nèi)實驗中,我們構(gòu)建了A375荷瘤小鼠模型,予以所獲得的TCR-T細胞輸注治療,PBS和空病毒轉(zhuǎn)染的T細胞(ctrl-T細胞)作為對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn),所構(gòu)建的TCR-T細胞能夠顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長,并顯著延長小鼠的生存時間。上述實驗結(jié)果證實,我們所構(gòu)建的NY-ESO-1特異性TCR-T細胞在體內(nèi)和體外均可有抗原特異性的IFN-γ的分泌,并且具有HLA-A2限制性的NY-ESO-1特異性的腫瘤殺傷效應。在成功獲得NY-ESO-1 TCR-T細胞后,我們進一步研究了DAC與TCR-T細胞是否具有協(xié)同治療效應。體外實驗中,我們采用0μM、0.1μM、1μM等不同濃度的DAC處理SW480細胞(NY-ESO-1~±/HLA-A2~+),并按照10:1、20:1、40:1等不同的效靶比與所構(gòu)建的TCR-T細胞共培養(yǎng)。結(jié)果證明,與未誘導的SW480細胞組相比,DAC誘導過的SW480細胞與所構(gòu)建的TCR-T細胞共培養(yǎng)后,LDH Assay檢測顯示所構(gòu)建的TCR-T細胞對DAC處理的SW480細胞的殺傷效應明顯高于未處理的SW480細胞。ELISPOT結(jié)果顯示,與未處理的SW480細胞組相比,DAC誘導過的SW480細胞與所構(gòu)建的TCR-T細胞共培養(yǎng)后,上清中IFN-γ細胞因子的水平明顯升高。體內(nèi)實驗中,我們將0μM、0.1μM、1μM等不同濃度的DAC處理的SW480細胞接種到重癥免疫缺陷NPG小鼠皮下,構(gòu)建了MSS的SW480荷瘤小鼠模型,然后進行所構(gòu)建的TCR-T細胞的輸注治療,每周一次,共三次,同時PBS和空病毒轉(zhuǎn)染的T細胞(ctrl-T細胞)作為對照,結(jié)果顯示,未經(jīng)DAC誘導的SW480細胞和經(jīng)過0.1μM DAC處理的SW480細胞組,在經(jīng)過TCR-T細胞治療后,其腫瘤生長得到一定的抑制,但是生存時間并沒有得到延長。1μM DAC處理組經(jīng)過TCR-T細胞的輸注治療后,腫瘤生長的抑制效應和生存期的延長明顯高于其它組。上述結(jié)果表明,MSS腫瘤細胞經(jīng)過適當濃度的DAC(1μM)的處理,能夠明顯的提高其對于TCR-T細胞的殺傷敏感性,從而抑制MSS腫瘤的生長并提高生存期,證實適量DAC與TCR-T細胞聯(lián)合治療具有協(xié)同抗腫瘤效應。通過本部分的研究,我們通過將DAC分別與兩種免疫治療方法PD-1單抗、NY-ESO-1特異性TCR-T細胞聯(lián)合應用,通過體內(nèi)外實驗,證實了DAC可以提高PD-1單抗、NY-ESO-1特異性TCR-T細胞的免疫治療的療效,對MSS腫瘤發(fā)揮了協(xié)同治療效應,為MSS腫瘤患者提供了新的治療策略和依據(jù)。同時,DAC特異性誘導腫瘤細胞表達NY-ESO-1等多種腫瘤抗原,為治療性疫苗、TCR-T細胞等以抗原為基礎的免疫治療提供了更多的靶點,以DAC為基礎的協(xié)同免疫治療有望顯著提高實體腫瘤患者的臨床療效。全文結(jié)果與結(jié)論:1、低劑量DAC可以顯著降低小鼠結(jié)直腸癌細胞CT26細胞以及人MSS性CRC的PDX模型腫瘤細胞基因組甲基化水平,提高結(jié)直腸癌細胞中抗原加工遞呈、細胞因子等基因的表達水平。低劑量DAC能夠通過靶基因啟動子區(qū)的去甲基化作用,誘導和提高MSI-H以及MSS性CRC細胞中NY-ESO-1抗原的表達。說明低劑量DAC改變了CRC細胞的免疫學特性,提高了其免疫原性。2、經(jīng)過低劑量DAC處理后的CRC腫瘤可以招募更多的CD4~+和CD8~+T淋巴細胞浸潤到腫瘤局部,具有更多的高分泌IFN-γ的細胞。這些浸潤的T淋巴細胞大多呈現(xiàn)PD-1陽性。說明低劑量DAC改變了CRC的腫瘤微環(huán)境,但是其狀態(tài)可能通過PD/PD-L1通路被抑制。3、低劑量DAC與PD-1單抗聯(lián)合應用可以顯著抑制小鼠體內(nèi)CRC腫瘤CT26的生長,并延長小鼠的生存期。說明低劑量DAC為PD-1單抗療效的發(fā)揮提供了良好的腫瘤微環(huán)境,而PD-1單抗再次激活了腫瘤微環(huán)境中被PD-1/PD-L1通路抑制的T淋巴細胞,發(fā)揮抗腫瘤效應。DAC和PD-1單抗能夠發(fā)揮協(xié)同性作用,提高抗腫瘤療效。4、通過慢病毒轉(zhuǎn)染人外周血T淋巴細胞,成功制備了NY-ESO-1特異性TCR-T細胞,并在體內(nèi)外進行了功能驗證。所制備的TCR-T細胞對HLA-A2限制性的NY-ESO-1陽性腫瘤具有良好的特異性識別和殺傷能力。5、低劑量DAC的預處理可以提高MSS性結(jié)直腸癌細胞中NY-ESO-1抗原的表達水平,與TCR-T細胞聯(lián)合應用可以明顯抑制腫瘤生長,延長小鼠生存期。說明低劑量DAC對腫瘤細胞的誘導為TCR-T細胞發(fā)揮抗腫瘤效應提供更多的靶點,提高TCR-T細胞治療的療效,兩者具有協(xié)同作用。
【圖文】：

- 32 -圖 1：CT26 細胞的全基因組甲基化測序結(jié)果Figure 1: Low dose DAC decreased the methylation level of promoter region in CT26 cells.(A) Violin map showed the methylation level of the control and the DAC-treated CT26 cells.Each violin represented a sample and every10 kb was regarded as a bin. (B) Comparison ofthe methylation level of antigen processing and presenting gene promoter regions in thecontrol and the DAC-treated CT26 cells. (C) Comparison of the methylation level ofrepresentative differentially expressed genes of the control and the DAC-treated CT26 cells.

也發(fā)現(xiàn)了與 CT26 細胞類似的結(jié)果。PDX 模型的腫瘤細胞經(jīng)過 DAC 處理后，其甲基化水平顯著下調(diào)（圖2A）。聚類分析發(fā)現(xiàn)，抗原加工和遞呈基因，，免疫相關基因和蛋白質(zhì)修飾基因中啟動子區(qū)域的甲基化水平明顯下調(diào)（圖 2B）。低劑量 DAC 能夠顯著降低 PDX 模型中腫瘤細胞的甲基化水平說明其在體內(nèi)也同樣可以發(fā)揮去甲基化的作用。圖 2：PDX 腫瘤的全基因組甲基化測序結(jié)果Figure 2: Low dose DAC decreased the methylation level of promoter region in tumors fromthe PDX model. (A) Violin map showed the methylation level of the control and the DAC-treated tumors. (B) Comparison of the methylation level of representative differentiallyexpressed genes in the control and the DAC-treated tumors.3. 低劑量 DAC 對 CT26 細胞表達譜的影響為了闡明低劑量 DAC 作用后的腫瘤細胞其基因的甲基化水平與表達之間的關系，我們對低劑量 DAC 處理和未處理的 CT26 細胞進行了全轉(zhuǎn)錄組測序。PCA 分析結(jié)果顯示，分別代表 CT26 細胞經(jīng) DAC 處理前、后的兩個點相距很遠（圖 3A，紅色點代表 DAC 處理前，藍色點代表 DAC 處理后），說明 CT26 細胞在經(jīng)過低劑量 DAC 處
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.34

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8 伍世鋼;羅楓;李進邦;劉坤平;;結(jié)直腸癌1085例臨床病理特征及預后分析[J];廣東醫(yī)學;2017年23期

9 陳勁松;;重視間期結(jié)直腸癌的預防[J];中華普通外科學文獻(電子版);2017年06期

10 王福奇;周全博;孫振強;劉金波;楊帥璽;連玉貴;孫獻濤;宋軍民;袁維堂;;河南地區(qū)結(jié)直腸癌發(fā)病特征分析[J];中國全科醫(yī)學;2018年03期

相關會議論文 前10條

1 夏文杰;邱福銘;黃建;;白介素-8與結(jié)直腸癌預后、臨床特點相關性薈萃分析[A];浙江省免疫學會第十次學術大會論文集[C];2016年

2 王曉學;汪建平;饒本強;鄧麗;黃緣;曾廣正;陳誠;;結(jié)直腸癌患者和健康人群糞便菌群及代謝產(chǎn)物的差異性研究[A];第十八屆中國中西醫(yī)結(jié)合學會大腸肛門病專業(yè)委員會學術會議暨甘肅省第五屆結(jié)直腸肛門外科學術年會論文匯編[C];2015年

3 阮錦成;崔q輝;卜賀啟;吳霜;蔡珂;潘海強;沈鋒;;結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關因素的研究進展[A];第十八屆中國中西醫(yī)結(jié)合學會大腸肛門病專業(yè)委員會學術會議暨甘肅省第五屆結(jié)直腸肛門外科學術年會論文匯編[C];2015年

4 練睿;;以急性癥狀首發(fā)的青年結(jié)直腸癌患者三例臨床分析[A];中華醫(yī)學會急診醫(yī)學分會第17次全國急診醫(yī)學學術年會論文集[C];2014年

5 陳智飛;李一權;孫麗麗;胡寧寧;周曄;李霄;金寧一;;雙特異性溶瘤腺病毒對結(jié)直腸癌的體內(nèi)外抑制研究[A];第九屆全國免疫學學術大會論文集[C];2014年

6 何超;勞偉峰;;結(jié)直腸癌外科治療進展[A];2009年浙江省腫瘤外科學術年會暨腫瘤外科規(guī)范化診治學習班論文匯編[C];2009年

7 何超;朱洪波;;結(jié)直腸癌的生物治療[A];2009年浙江省腫瘤外科學術年會暨腫瘤外科規(guī)范化診治學習班論文匯編[C];2009年

8 萬德森;;進一步提高結(jié)直腸癌療效的思考[A];2009年浙江省腫瘤學術年會暨腫瘤診治新進展學習班論文匯編[C];2009年

9 王哲海;;結(jié)直腸癌的診斷與系統(tǒng)性化療[A];山東省第四屆“CSCO——山東”首屆腫瘤化療學習班論文匯編[C];2009年

10 鄧小梅;鄭桂喜;王傳新;張建;李偉;張曉;;結(jié)直腸癌患者血清蛋白質(zhì)譜檢測的意義[A];中華醫(yī)學會第八次全國檢驗醫(yī)學學術會議暨中華醫(yī)學會檢驗分會成立30周年慶典大會資料匯編[C];2009年

相關重要報紙文章 前10條

1 本報記者 楊柳;關注結(jié)直腸癌——莫讓“出路”受阻[N];中國醫(yī)藥報;2018年

2 記者 孫國根 王瀟雨;抗結(jié)直腸癌新藥自主研發(fā)成功[N];健康報;2018年

3 特約記者 袁蕙蕓;共生梭菌檢測有望早診結(jié)直腸癌[N];健康報;2018年

4 張建新;結(jié)直腸癌趨向規(guī)范化綜合診療新模式[N];人民政協(xié)報;2018年

5 本報記者 賈婧;互聯(lián)網(wǎng)+技術破解防癌“早篩”痛點[N];科技日報;2016年

6 李治中;中國癌癥生存率低于美國5大原因[N];北京科技報;2016年

7 南方日報記者 朱曉楓 通訊員 黃金娟 王德深 蒲恒穎;晚期患者生存期延至27個月[N];南方日報;2017年

8 本報記者 過國忠 通訊員 吳錫平 高曉敏;癌癥持續(xù)高發(fā)，1/3本來可預防[N];科技日報;2017年

9 本報記者 張藝馨;液態(tài)活檢破冰腫瘤早篩市場[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2017年

10 本報記者 董超;圍剿結(jié)直腸癌靠“三早”[N];保健時報;2017年

相關博士學位論文 前10條

1 李月;長鏈非編碼RNA XLOC_010588和NAV2-AS5調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌侵襲遷移作用的研究[D];中國醫(yī)科大學;2018年

2 黃曉婷;Snail/FOXK1/Cyr61信號軸參與調(diào)控結(jié)直腸癌的EMT及轉(zhuǎn)移[D];南方醫(yī)科大學;2018年

3 谷川莎;FSTL1對結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程的影響及其分子機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2018年

4 李曉敏;CircITGA7在人結(jié)直腸癌生長及轉(zhuǎn)移中的作用和分子機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2018年

5 杜瑞;miR-760靶向EphB3調(diào)控結(jié)直腸癌進展的分子機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2018年

6 李勝;循環(huán)腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與結(jié)直腸癌臨床相關性研究[D];南方醫(yī)科大學;2018年

7 游文獻;結(jié)直腸癌中差異表達circRNA的篩選及其功能研究[D];重慶醫(yī)科大學;2018年

8 張倩;激活突變SHP2~(E76K)酪氨酸磷酸酶對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的影響及其分子機制研究[D];安徽醫(yī)科大學;2018年

9 王彬;LASP2通過JNK/p38 MAPK信號通路介導的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制結(jié)直腸癌進展的相關研究[D];南方醫(yī)科大學;2018年

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本文編號：2665039