【摘要】：超級(jí)增強(qiáng)子(super enhancer,SE)是具有強(qiáng)大活性增強(qiáng)子的一個(gè)大簇,通常含有數(shù)個(gè)組分增強(qiáng)子區(qū)域,較普通增強(qiáng)子體量更大且更能驅(qū)動(dòng)控制細(xì)胞身份基因等重要基因的表達(dá),進(jìn)化上趨向于存于與發(fā)育相關(guān)的重要基因附近,通常在20kbp以內(nèi),且有CTCF區(qū)域形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)以限制其增強(qiáng)功能作用于特定靶基因,在發(fā)育和腫瘤等疾病發(fā)生過(guò)程中起到重要作用。通過(guò)生物信息學(xué)的方法,本課題在多種腫瘤細(xì)胞系中篩選出以H3K27ac和H3K4me1的高水平組蛋白修飾為首要標(biāo)志,輔以CTCF成環(huán)預(yù)測(cè),鑒別出多個(gè)潛在的腫瘤特異性超級(jí)增強(qiáng)子。隨后我們通過(guò)CRISPR-CAS9基因編輯技術(shù)敲除了位于PLAU基因上游的超級(jí)增強(qiáng)子片段,隨即發(fā)現(xiàn)敲除該片段特異性降低PLAU(u-pa)的表達(dá),并引起了Hela細(xì)胞的一系列生理特性變化,包括增殖率降低,遷移及侵襲性明顯下降,對(duì)胞外基質(zhì)的親和力上升,對(duì)順鉑的敏感度上升等。通過(guò)CRISRPCas9技術(shù),進(jìn)一步明確了該超級(jí)增強(qiáng)子的組分位置及各個(gè)組分的活性強(qiáng)度,在獲得敲除最高轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域的細(xì)胞系后,后續(xù)的裸鼠成瘤及腫瘤染色均表明該區(qū)域的缺失會(huì)降低Hela細(xì)胞在體內(nèi)的惡性程度并使腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感度增加,提示該區(qū)域是一個(gè)潛在的抗腫瘤靶向區(qū)域。最后,通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)的方法檢測(cè)了Hela細(xì)胞在低氧和順鉑處理情況下該超級(jí)增強(qiáng)子的活性變化,發(fā)現(xiàn)低氧條件(5%O2,36h)誘導(dǎo)該超級(jí)增強(qiáng)子活性提高,而順鉑處理(4μg/ml,48h)使該區(qū)域活性降低,提示低氧條件可能部分通過(guò)活化超級(jí)增強(qiáng)子來(lái)增加腫瘤細(xì)胞的惡性程度,順鉑則可能部分通過(guò)降低超級(jí)增強(qiáng)子的活性來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)。結(jié)論:人宮頸癌細(xì)胞通過(guò)特異性激活超級(jí)增強(qiáng)子PLAU-SE提高細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及耐藥能力,且低氧刺激會(huì)加強(qiáng)PLAU-SE的活性。PLAU-SE敲除會(huì)降低上述細(xì)胞惡性表現(xiàn),是一個(gè)有潛在應(yīng)用價(jià)值的靶向位點(diǎn)。
【圖文】：

1.2.1 SE 的定義通過(guò)在全基因組水平的生物信息學(xué)分析，Young 等人通過(guò)分析 Key-TFS（關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子）和中間復(fù)合體的結(jié)合點(diǎn)，在小鼠 ES 細(xì)胞內(nèi)首次提出了超級(jí)增強(qiáng)子的概念，即一串具有強(qiáng)大促轉(zhuǎn)錄功能的增強(qiáng)子集合。利用高通量染色質(zhì)免疫互作結(jié)果，Young 等人分析了與控制細(xì)胞分化方向密切相關(guān)的數(shù)個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的共同結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)其所在位置共鑒定出了 8800 個(gè)增強(qiáng)子區(qū)域，而在這 8800 個(gè)增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)，有 231 個(gè)增強(qiáng)子與轉(zhuǎn)錄中間復(fù)合體的結(jié)合密度遠(yuǎn)高于剩余增強(qiáng)子。后續(xù)的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些具有同中間復(fù)合體高密度結(jié)合的增強(qiáng)子還存在以下特性，即：高水平的組蛋白修飾（H3K27ac，H3K4me1），高水平的染色質(zhì)修飾（p300），和高水平的 DNaseI Hypersensitivity Clusters 集合。超級(jí)增強(qiáng)子與中間復(fù)合體的結(jié)合模式如圖 1-1 所示。具有這些特質(zhì)的增強(qiáng)子在結(jié)構(gòu)上常常與控制細(xì)胞分化狀態(tài)和分化方向的重要基因相關(guān)聯(lián)，為了表明這一類增強(qiáng)子的特殊性，Young 等人將其稱為超級(jí)增強(qiáng)子（SE）[6-8]。

哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)論文的的幾個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域進(jìn)行高通量染色質(zhì)免疫互作測(cè)序分析，在獲得序列后，挑選出其共同結(jié)合區(qū)域分析，若這些與關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的增強(qiáng)子區(qū)域在基因組水平上臨近（間距小于 12.5kb），則拼接為一個(gè)增強(qiáng)子串，，接著分析增強(qiáng)子串和單一增強(qiáng)子與中間復(fù)合體的結(jié)合水平，依照其強(qiáng)度繪制曲線圖，人為劃定曲線斜率高于 1 的為超級(jí)增強(qiáng)子，低于 1 的為普通增強(qiáng)子。由于-2 為生物信息學(xué)方法鑒定超級(jí)增強(qiáng)子的流程圖。由于超級(jí)增強(qiáng)子在不同細(xì)胞、不同時(shí)期內(nèi)激活狀態(tài)呈現(xiàn)顯著差異，且不同重要基因所需要的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子各不相同，在無(wú)法得知某一重要基因最需要的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子是什么時(shí)，這種方法并不適用[13-19]，鑒于此，Abranham等人通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在增強(qiáng)子共有的分子標(biāo)識(shí)中，H3K27ac 為置信度最高的標(biāo)志。利用 H3K27ac 的豐度，聯(lián)合考慮增強(qiáng)子體量，可較為準(zhǔn)確地初篩超級(jí)增強(qiáng)子[6-8]。本實(shí)驗(yàn)室的劉洪波博士已于前期構(gòu)建了基于體量和各分子標(biāo)記豐度預(yù)測(cè)多個(gè)細(xì)胞系內(nèi)特異性活化的超級(jí)增強(qiáng)子的方法和網(wǎng)站 SEA，其結(jié)果發(fā)表于NAR 上[20]
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q78;R73

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本文編號(hào)：2654686