【摘要】：背景:胰腺癌惡性程度高且預(yù)后極差,盡管根治性手術(shù)是最有效的治療方式,但是由于確診時(shí)多數(shù)胰腺癌患者已伴隨遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或局部侵犯,因此手術(shù)可切除率低。盡管腫瘤生物學(xué)在近年獲得了極大的進(jìn)展,但是胰腺癌轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚不明確,因此深入分析胰腺癌發(fā)生發(fā)展的病理特點(diǎn),并進(jìn)行相關(guān)的分子機(jī)制研究以研發(fā)新的診療手段是目前胰腺癌基礎(chǔ)研究及轉(zhuǎn)化研究的當(dāng)務(wù)之急。胸苷酸合成酶是一種基礎(chǔ)代謝酶,在細(xì)胞生長(zhǎng)增殖過程中起重要作用�？剐剀账岷铣擅覆呗砸呀�(jīng)成為一種有效的癌癥治療手段。然而,胸苷酸合成酶對(duì)胰腺癌的真正影響仍存在爭(zhēng)議。很多研究稱TS高表達(dá)與癌癥不良預(yù)后相關(guān),如大腸癌、肺癌、胰腺癌等,但是也有研究提出相反的觀點(diǎn)認(rèn)為TS高表達(dá)的胰腺癌患者預(yù)后更好。為了進(jìn)一步揭示TS與胰腺癌的關(guān)系,我們系統(tǒng)地評(píng)估了胸苷酸合成酶在胰腺癌預(yù)后中的價(jià)值以及胸苷酸合成酶是否與胰腺癌的轉(zhuǎn)移進(jìn)展相關(guān)。在本項(xiàng)研究中,我們首次將胰腺癌組織樣本胞漿和胞核中胸苷酸合成酶的表達(dá)分別進(jìn)行獨(dú)立的臨床意義評(píng)估。在發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞核中TS高表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移及患者不良預(yù)后相關(guān)的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步利用體外實(shí)驗(yàn)探索了胸苷酸合成酶對(duì)胰腺癌細(xì)胞系生物學(xué)行為影響,并最終利用兩種胰腺癌轉(zhuǎn)移模型驗(yàn)證了胸苷酸合成酶和胰腺癌轉(zhuǎn)移侵襲能力的相關(guān)性。方法:從2007年1月至2016年1月間,隨機(jī)收集91例胰腺癌組織樣本(其中71例蠟塊包埋組織樣本,20例新鮮冰凍樣本)及其相對(duì)應(yīng)的正常胰腺組織。整理樣本臨床資料,利用定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction,q-PCR)分析新鮮冰凍胰腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織中TS的表達(dá)差異;利用免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)染色法對(duì)石蠟包埋的胰腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織中TS的表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并結(jié)合臨床資料進(jìn)行臨床意義分析。在體外實(shí)驗(yàn)中,我們使用含人源性shTS序列慢病毒載體轉(zhuǎn)染PANC-1胰腺癌細(xì)胞株,建立TS基因short hairpin RNA(shRNA)穩(wěn)轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1-shTS。利用cellcounting kit-8(CCK-8)試劑盒每24小時(shí)檢測(cè)TS對(duì)PANC-1細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。利用噻唑藍(lán)(methyl thiazolyltetrazolium,MTT)檢測(cè)各種化療藥物對(duì)胰腺癌細(xì)胞系的影響。此外,我們利用劃痕和Transwell法觀察PANC-1細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性能。使用western blot法和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)PANC-1細(xì)胞EMT進(jìn)程中各關(guān)鍵蛋白表達(dá)量,為了進(jìn)一步驗(yàn)證TS對(duì)EMT進(jìn)程的調(diào)節(jié),我們檢測(cè)了 TS缺如對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞EMT的影響。同時(shí),為了尋找潛在機(jī)制,我們使用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法檢測(cè)了胰腺癌細(xì)胞裂解產(chǎn)物中TS下游代謝產(chǎn)物脫氧胸苷酸(deoxyadenosine triphosphate,dTMP)的含量,并研究 dTMP 對(duì)胰腺癌細(xì)胞 EMT的影響。此外,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中我們使用原位胰腺癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型和胰腺癌肺循環(huán)轉(zhuǎn)移模型,結(jié)合磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI),計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography,CT)和正電子發(fā)射斷層掃描(positron emission tomography,PET)技術(shù)系統(tǒng)評(píng)估了 TS對(duì)胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響,并利用IHC法分析裸鼠胰腺癌轉(zhuǎn)移瘤中細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki-67的表達(dá)。結(jié)果:q-PCR結(jié)果顯示在20例新鮮冰凍胰腺癌組織樣本中共有9例出現(xiàn)了 TS基因表達(dá)量顯著增高(≥2倍,最高者達(dá)到19倍)。同時(shí),western blot結(jié)果表明在公認(rèn)的具有更高惡性生物學(xué)行為的胰腺癌細(xì)胞株中,TS的表達(dá)量也出現(xiàn)了相應(yīng)增高。IHC分析表明TS廣泛分布于胰腺癌腫瘤細(xì)胞和癌旁導(dǎo)管上皮細(xì)胞的胞漿與胞核中。雖然胰腺癌腫瘤細(xì)胞胞漿中TS表達(dá)率(p=0.637)與染色強(qiáng)度(p=0.611)并無顯著增高,但腫瘤細(xì)胞胞漿中TS的表達(dá)與周圍神經(jīng)侵犯及腫瘤組織學(xué)分級(jí)密切相關(guān)�？ㄆ仗m-邁耶分析也證實(shí),胞漿中TS表達(dá)強(qiáng)度低的胰腺癌患者的總生存率雖稍有改善,但是并不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.84)。但是胰腺癌腫瘤細(xì)胞和癌旁導(dǎo)管上皮細(xì)胞的胞核中TS的表達(dá)不僅在染色率上有明顯差異,而且癌組織細(xì)胞核中TS的表達(dá)量與胰腺癌病理分級(jí)(p=0.043)和淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(p=0.016)。生存分析則進(jìn)一步表明腫瘤細(xì)胞核中TS的表達(dá)與患者總體生存期呈顯著負(fù)相關(guān)(p=0.015)。因此,TS是胰腺癌預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)記物,而且在胰腺癌惡性進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),雖然TS對(duì)PACN-1細(xì)胞的增殖速度并無明顯影響。但TS敲除的胰腺癌細(xì)胞對(duì)不同濃度吉西他濱(gemcitabine,GEM)的化療敏感性均顯著提升,但是對(duì)于5-氟尿嘧淀(5-fluorouracil,5-FU)和厄洛替尼的作用卻無明顯影響。Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕試驗(yàn)表明TS的低表達(dá)能明顯削弱PANC-1細(xì)胞的侵襲和遷移能力。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示在PANC-1-shTS細(xì)胞株中,上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)增加,而EMT進(jìn)程中涉及的轉(zhuǎn)錄因子,如Snail,Vimentin和ZEB-1表達(dá)量均下降。而β-catenin作為EMT中標(biāo)志性的核轉(zhuǎn)位蛋白,在PANC-1-shTS細(xì)胞的胞漿和胞核中表達(dá)量均降低。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示在PANC-1-shTS細(xì)胞中,細(xì)胞膜上E-cadherin表達(dá)增加,細(xì)胞漿中β-catenin重新分布,相應(yīng)地,胞漿中Vimentin表達(dá)降低。除此之外,westernblot和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)均表明TGF-β作用后引起的β-catenin核轉(zhuǎn)位增多和Vimentin過表達(dá)現(xiàn)象在PANC-1-shTS細(xì)胞中均被弱化。HPLC結(jié)果表明在dTMP在PANC-1野生型(wildtype,WT)和 PANC-1-shcontrol 中表達(dá)量相近,而在 PANC-1-shTS 細(xì)胞中,dTMP含量顯著減少。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示,10OμM dTMP作用于胰腺癌細(xì)胞株24小時(shí)后,E-cadherin幾乎不表達(dá),而相對(duì)地,Snail,Vimentin,ZEB-1的表達(dá)量均顯著增加,這一現(xiàn)象在PANC-1-shTS細(xì)胞中同樣被觀察到。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)小鼠胰腺癌轉(zhuǎn)移模型中,影像學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明,sh-TS實(shí)驗(yàn)組中原位胰腺腫瘤的生長(zhǎng)被抑制且肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著減少,同時(shí)生存分析結(jié)果表明低表達(dá)TS可顯著改善荷瘤裸鼠的總生存率。在胰腺癌裸鼠肺循環(huán)轉(zhuǎn)移模型中,影像學(xué)檢測(cè)結(jié)果也同樣證實(shí)低表達(dá)TS可明顯抑制裸鼠肺臟內(nèi)胰腺癌轉(zhuǎn)移灶的形成。最后,免疫組化分析結(jié)果表明,肝臟和肺臟的轉(zhuǎn)移瘤中,TS敲除能顯著降低Ki-67的表達(dá)。結(jié)論:臨床樣本免疫組化分析顯示胰腺癌腫瘤細(xì)胞核中TS高表達(dá)可能與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān),并提示預(yù)后不良。體外研究顯示PDACs中TS基礎(chǔ)表達(dá)量和GEM耐藥程度正相關(guān),而sh-TS可顯著提高GEM對(duì)胰腺癌細(xì)胞作用的敏感性,并抑制胰腺癌細(xì)胞株的侵襲和遷移能力。后續(xù)機(jī)制研究提示,TS通過下游產(chǎn)物dTMP影響dNTP池的平衡可能是其調(diào)控胰腺癌EMT相關(guān)侵襲遷移能力的潛在機(jī)制。sh-TS不僅同時(shí)抑制原位胰腺癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型和肺循環(huán)轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型中胰腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力,且可顯著改善荷瘤裸鼠的總生存率。而免疫組化則證實(shí)細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki-67在sh-TS組轉(zhuǎn)移灶內(nèi)也出現(xiàn)了顯著下調(diào)。
【圖文】：

我們提�。玻袄迈r冰凍胰腺癌及相對(duì)應(yīng)的癌旁組織樣本中ＲＮＡ，并進(jìn)行逡逑ｑ－ＰＣＲ分析，結(jié)果顯示，在部分胰腺癌組織４５％邋（９／２０）中ＴＳ基因的表達(dá)量高于逡逑其對(duì)應(yīng)癌旁組織２倍以上，差異最大者達(dá)到１９倍（圖１．１）。逡逑２２１逡逑ｉ２0－邐？邐？逡逑ｃ邋１８－逡逑？２邋１ｆｉ邋？逡逑８邋１６＿逡逑￡邋１４－逡逑ｘ邋１２－逡逑Ｉ邋１０－邐？逡逑Ｑ）邋８－逡逑＾邋６－邋？邋？逡逑１邋４－邋？逡逑0邋｜卞邋Ｉ邋￣Ｉ邋￣￣Ｉ邋￣Ｉ邋￣￣邋丨令卞邋１邋￣￣Ｉ－－１邋Ｉ邋Ｉ邋￣Ｉ邋￣￣Ｉ邋￣￣Ｉ邋￣Ｉ邋Ｉ邋１邋，逡逑ｔ－ｃｎｃｏ邋對(duì)邐①卜邋000＞0逡逑ＣＭ逡逑圖１．１胰腺癌組織與相對(duì)應(yīng)癌旁組織中ＴＳ基因總體表達(dá)量差異分析圖逡逑？邐鑒于ｑ－ＰＣＲ分析僅能反應(yīng)ＴＳ在基因水平上的表達(dá)情況，而ＴＳ蛋白才是在體逡逑內(nèi)發(fā)揮功能的活性物質(zhì)。因此，我們利用ＩＨＣ染色法進(jìn)一步分析ＴＳ蛋白在胰腺癌逡逑及癌旁組織中的定位及表達(dá)情況。逡逑我們對(duì)７１例胰腺癌及癌旁蠟塊組織樣本進(jìn)行免疫俎化染色，結(jié)果表明，ＴＳ逡逑蛋白在不同分化程度的胰腺癌組織中普遍表達(dá)（圖１．１），且廣泛分布于胰腺癌組逡逑織和癌旁組織的細(xì)胞漿與細(xì)胞核中（圖１．２）。結(jié)合上述ｑ－ＰＣＲ結(jié)果，我們推測(cè)逡逑ＴＳ在癌組織和正常組織中均有表達(dá)，在細(xì)胞增殖過程不可或缺，而ＴＳ的異常表逡逑達(dá)可能與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。逡逑９逡逑

正文第？部分結(jié)果逡逑：＇Ｖ媭⑷．：：．．＼：：Ｋ＇：＇逡逑圖１．２邋ＴＳ蛋白（黃褐色顆粒）在胰腺癌組織（Ａ）和癌旁組織（Ｂ）中的染色圖逡逑染色圖可清晰顯示胰腺癌及癌旁組織胞漿和胞核中均有ＴＳ表達(dá)（比例尺為５０ｐｍ）逡逑Ａ邋：邋：‘NB邋．邋＇邐＇邋°邐…懰逡逑．＇邋Ａ．＂邐，逡逑圖１．３高分化（Ａ）、中分化（Ｂ）、低分化（Ｃ）胰腺癌組織中逡逑ＴＳ蛋白染色的代表性圖片逡逑１．３．２邋ＴＳ在胰腺癌及癌旁組織細(xì)胞漿中的表達(dá)及其臨床意義逡逑為進(jìn)一步揭示ＴＳ與胰腺癌的關(guān)系，我們分別獨(dú)立研究細(xì)胞漿和細(xì)胞核中ＴＳ逡逑的表達(dá)及相關(guān)臨床意義。首先我們分析ＴＳ在胰腺癌腫瘤細(xì)胞和癌旁導(dǎo)管上皮細(xì)胞逡逑漿中的表達(dá)差異，再結(jié)合臨床資料分析胰腺癌細(xì)胞漿中ＴＳ的表達(dá)與臨床病理特征逡逑之間的關(guān)系。逡逑１．３．２．１邋ＴＳ在胰腺癌腫瘤細(xì)胞漿和癌旁導(dǎo)管上皮細(xì)胞胞漿中的表達(dá)差異逡逑我們對(duì)７１例蠟塊包埋胰腺癌及癌旁組織的細(xì)胞胞漿中ＴＳ蛋白表達(dá)情況進(jìn)行逡逑ＩＨＣ染色分析，結(jié)果顯示在７１例胰腺癌細(xì)胞胞漿中ＴＳ的免疫組化染色結(jié)果中，逡逑５９例ＴＳ蛋白表達(dá)陽性，１２例表達(dá)陰性；在相對(duì)應(yīng)的癌旁組織中，６２例ＴＳ蛋白逡逑表達(dá)陽性，９例表達(dá)陰性，，卡方檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示ｐ值為０．６３７，不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意逡逑義。表明胰腺癌與癌旁組織細(xì)胞漿中ＴＳ的染色率無顯著差異（表１．１）。逡逑１０逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.9

【參考文獻(xiàn)】

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2 葉燕麗,周昕熙,王蓮桂;裸小鼠的繁殖及在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用[J];實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理;2005年01期

3 陳笑雷,張群華;胰腺癌轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)的臨床病理特點(diǎn)[J];肝膽胰外科雜志;2003年03期

4 師長(zhǎng)宏,施新猷;裸鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型研究進(jìn)展[J];上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué);2000年02期

本文編號(hào)：2634951