【摘要】：背景:膠原表達(dá)的增加和沉積與乳腺癌發(fā)展及癌癥病人的不良預(yù)后相關(guān)。乳腺密度是乳腺癌發(fā)病的一個(gè)危險(xiǎn)因素,乳腺密度增加部分由于膠原蛋白沉積增加。在結(jié)腸癌、宮頸癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌等上皮來源的腫瘤中均可檢測到膠原XIII m RNA表達(dá)增加。然而膠原XIII在乳腺癌中的功能和調(diào)控機(jī)制尚不明確。盡管膠原XIII在細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間發(fā)揮作用,但它是否在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起作用仍有待研究。目的:本研究通過在TNBC細(xì)胞和正常乳腺上皮細(xì)胞中敲除及過表達(dá)膠原XIII,探討其對乳腺癌細(xì)胞惡性表型和干細(xì)胞樣特性的作用;通過使用活化的β1整合素功能阻斷性抗體,探討膠原XIII通過β1整合素激活TGF-β通路;通過小鼠異種移植實(shí)驗(yàn)及肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),探討膠原XIII在腫瘤原位生長及轉(zhuǎn)移中的作用。從而最終明確膠原XIII促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。方法:(1)使用蛋白免疫印跡(westernblot)法檢測膠原XIII在多種正常乳腺上皮細(xì)胞及不同類型乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)量。通過生物信息學(xué)分析,統(tǒng)計(jì)正常乳腺組織與乳腺癌組織,惡性程度不同的乳腺癌組織及總體生存期不同的乳腺癌患者體內(nèi)膠原XIII表達(dá)量的差異。明確膠原XIII與乳腺癌發(fā)展之間的關(guān)系。(2)使用Crispr/cas9基因敲除技術(shù)建立MDA-MB-231-Col13-/-細(xì)胞系,并篩選得到兩個(gè)單克隆MDA-MB-231-Col13-/-(25)和MDA-MB-231-Col13-/-(28)。通過基因組測序技術(shù)和westernblot確認(rèn)COL13A1基因敲除成功。使用含有膠原XIII過表達(dá)的慢病毒感染MCF-10A細(xì)胞,得到MCF-10A-Col13細(xì)胞系。通過westernblot和免疫熒光染色確認(rèn)膠原XIII成功表達(dá)。使用Crispr/cas9和慢病毒技術(shù)構(gòu)建T4-2-Ctrl,T4-2-Col13-/-和T4-2-Col13細(xì)胞系,通過western確認(rèn)膠原XIII敲除及過表達(dá)。(3)通過MDA-MB-231-Col13-/-(25/28)和MCF-10A-Col13細(xì)胞的體外3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和單個(gè)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn),研究膠原XIII誘導(dǎo)的侵襲性表型形成;通過免疫熒光染色,統(tǒng)計(jì)不同時(shí)間點(diǎn)Ed U和caspase3陽性的細(xì)胞數(shù),研究膠原XIII對細(xì)胞增殖和凋亡的影響。通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測T4-2-Ctrl,T4-2-Col13-/-和T4-2-Col13細(xì)胞的侵襲性改變。(4)通過在懸浮條件下乳腺腫瘤微球形成實(shí)驗(yàn)研究膠原XIII對癌細(xì)胞集落形成能力的影響。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測懸浮培養(yǎng)條件下細(xì)胞表面磷脂酰絲氨酸的表達(dá)量變化,利用westernblot檢測PARP-cleaved的表達(dá)量。通過乳腺腫瘤微球形成實(shí)驗(yàn),檢測T4-2-Ctrl,T4-2-Col13-/-和T4-2-Col13細(xì)胞的集落形成能力改變。明確膠原XIII在增強(qiáng)癌細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性中發(fā)揮的作用。(5)通過免疫熒光染色,研究膠原XIII對整合素β1的活化作用。通過使用活化的整合素β1功能阻斷性抗體,明確膠原XIII誘導(dǎo)的癌細(xì)胞浸潤侵襲和遷移能力、乳腺微球形成和失巢凋亡抵抗能力至少是部分通過整合素β1實(shí)現(xiàn)的。(6)通過westernblot實(shí)驗(yàn)觀察不同時(shí)間點(diǎn)p-Smad2/3和Smad2/3比值的變化,結(jié)合TGF-β誘導(dǎo)的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),研究膠原XIII對TGF-β1信號通路的活化作用。加入活化的整合素β1功能阻斷性抗體后,對該通路活化作用的影響。明確膠原XIII可通過整合素β1激活TGF-β信號通路。(7)構(gòu)建表達(dá)生物熒光素酶的MDA-MB-231-luc-D3H2LN-Ctrl/Col13-/-細(xì)胞系和綠色熒光蛋白標(biāo)記的MDA-MB-231-GFP-Ctrl/Col13-/-細(xì)胞系。通過尾靜脈及乳腺脂肪墊注射入SCID小鼠體內(nèi),建立TNBC細(xì)胞的異種移植和肺轉(zhuǎn)移模型。通過心臟注射建立TNBC細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移模型。通過生物發(fā)光體內(nèi)成像系統(tǒng)(invivo imaging system,IVIS),熒光照相機(jī)和HE(hematoxylin-eosin)染色檢測腫瘤原位生長、肺部定植和骨轉(zhuǎn)移的能力,明確高表達(dá)的膠原XIII在促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞原位生長和轉(zhuǎn)移過程中的作用。結(jié)果:(1)乳腺癌的發(fā)展伴隨著膠原XIII的誘導(dǎo)表達(dá):Westernblot結(jié)果顯示,TNBC細(xì)胞系比管腔樣乳腺癌細(xì)胞系或非惡性乳腺上皮細(xì)胞系的膠原XIII表達(dá)量更高。芯片數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示,人乳腺癌組織中膠原XIII m RNA水平顯著高于正常乳腺組織(p0.01);ER陰性的乳腺癌組織中膠原XIII m RNA的表達(dá)量高于ER陽性的乳腺癌組織(p0.01);TNBC組織中膠原XIII m RNA的表達(dá)量高于其它亞類的乳腺癌組織(p0.01);Kaplan-Meier logrank分析結(jié)果顯示,膠原XIII高表達(dá)的乳腺癌患者總體生存期低于膠原XIII低表達(dá)的乳腺癌患者(p0.001)。ER陰性的乳腺癌患者中,膠原XIII表達(dá)量高者的總體生存期更短(p0.001)。(2)膠原XIII促進(jìn)TNBC細(xì)胞侵襲性惡性表型形成:與對照組相比,MDAMB-231-Col13-/-(25/28)中侵襲性分支顯著降低(克隆25:p0.001;克隆28:p0.001)。膠原XIII過表達(dá)增加MCF-10A細(xì)胞的3D克隆體積(day4,p0.05;day5~day11,p0.001)。MCF-10A-Col13組的Ed U陽性率顯著高于對照組(day6,p0.001;day8,p0.001;day10,p0.001)。膠原XIII過表達(dá)的MCF-10A細(xì)胞中可檢測到活化的caspase3有減少的趨勢(p=0.098)。膠原XIII敲除顯著降低MDA-MB-231細(xì)胞的浸潤侵襲能力(克隆25:p0.01;克隆28:p0.01)。相反,過表達(dá)膠原XIII的MCF-10A細(xì)胞浸潤侵襲能力高于對照組(p0.05)。膠原XIII敲除的MDA-MB-231細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞遷移速度和距離均降低(速度:克隆25,p0.05;克隆28,p0.05;距離:克隆25,p0.05;克隆28,p0.05)。而膠原XIII過表達(dá)可顯著提高M(jìn)CF-10A細(xì)胞的遷移速度和距離(速度,p0.001;距離,p0.001)。膠原XIII敲除可降低T4-2細(xì)胞的浸潤侵襲能力(p0.05),而過表達(dá)膠原XIII不能顯著提高其浸潤侵襲的能力。(3)膠原XIII的表達(dá)增強(qiáng)癌細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性:膠原XIII敲除的MDAMB-231細(xì)胞腫瘤微球形成率低于對照組(克隆25,p0.001;克隆28,p0.001)。相反,過表達(dá)膠原XIII的MCF-10A細(xì)胞乳腺微球形成率高于對照組(p0.001)。在MCF-10A細(xì)胞中膠原XIII的表達(dá)降低了懸浮培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)的細(xì)胞表面磷脂酰絲氨酸(p0.01)和PARP-cleaved的表達(dá)量。而在MDA-MB-231細(xì)胞中,膠原XIII沉默表達(dá)增加了細(xì)胞表面磷脂酰絲氨酸的量(p0.001)。膠原XIII敲除可降低T4-2細(xì)胞的腫瘤微球形成率(p0.05),而過表達(dá)膠原XIII不能顯著提高該能力。(4)膠原XIII通過整合素β1促進(jìn)腫瘤微球的形成和激活TGF-β信號通路:膠原XIII敲除的MDA-MB-231細(xì)胞中活化的整合素β1位點(diǎn)減少(克隆25,p0.01;克隆28,p0.001)。相反,過表達(dá)膠原XIII的MCF-10A細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)整合素β1的活化(p0.01)。整合素β1功能阻斷性抗體可降低MCF-10A細(xì)胞中膠原XIII誘導(dǎo)的單個(gè)細(xì)胞遷移(速度,p0.001;距離,p0.001)、侵襲(p0.01)和乳腺微球形成(p0.05)能力。在過表達(dá)膠原XIII的MCF-10A細(xì)胞中抑制整合素β1的活性可增加PARP-cleaved的表達(dá)量。與對照組相比,在膠原XIII敲除的MDA-MB-231細(xì)胞中,TGF-β誘導(dǎo)的Smad2/3磷酸化水平降低(MDA-MB-231-Col13-/-(25):0.5h,p0.05;1.0h,p0.05;2.0h,p0.05;24h,p0.05;MDA-MB-231-Col13-/-(28):0.5h,p0.05;1.0h,p0.05;2.0h,p0.05;24h,n.s.)。與westernblot結(jié)果一致,膠原XIII敲除的MDA-MB-231細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(p0.01)。這些實(shí)驗(yàn)在MCF-10A細(xì)胞系中得到重復(fù),外源性表達(dá)的膠原XIII增強(qiáng)TGF-β誘導(dǎo)的Smad2/3磷酸化(0.5h,p0.05;1.0h,p0.05;2.0h,p0.05)及報(bào)告基因活性熒光素酶活性(p0.001)。重要的是,整合素β1功能阻斷性抗體可顯著降低由膠原XIII增強(qiáng)的Smad2/3磷酸化。(5)膠原XIII沉默表達(dá)抑制小鼠體內(nèi)乳腺癌的轉(zhuǎn)移:在肺定植模型中,尾靜脈注射對照組細(xì)胞的小鼠在5周內(nèi)出現(xiàn)肺定植,而膠原XIII沉默組小鼠的肺定植情況顯著降低(p0.05)。HE染色進(jìn)一步確認(rèn)了膠原XIII沉默抑制SCID小鼠體內(nèi)癌細(xì)胞的肺定植(p0.05)。在異種移植乳腺腫瘤模型中,膠原XIII沉默會(huì)降低腫瘤的生長速度(day23,p0.05;day25,p0.05),同時(shí)肺轉(zhuǎn)移有減少的趨勢(p=0.164)。在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型中,膠原XIII沉默組小鼠乳腺癌的整體轉(zhuǎn)移率低于對照組(p=0.09),但骨轉(zhuǎn)移無顯著差異。結(jié)論:(1)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展伴隨著膠原XIII表達(dá)的增加;(2)TNBC細(xì)胞中膠原XIII表達(dá)的增加通過增強(qiáng)癌細(xì)胞遷移和侵襲促進(jìn)3D培養(yǎng)惡性表型;(3)膠原XIII通過增強(qiáng)癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性和相關(guān)的失巢凋亡抵抗促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展;(4)膠原XIII通過β1整合素增強(qiáng)TGF-β信號通路,從而促進(jìn)癌癥的發(fā)展進(jìn)程;(5)TNBC中膠原XIII表達(dá)的增加可通過增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和干細(xì)胞樣特性促進(jìn)癌細(xì)胞的定植和轉(zhuǎn)移;
【圖文】：

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文2圖1.1 基底膜的結(jié)構(gòu)[3]Fig. 1.1 Schematic illustration of a BM[3]圖中所示多種聚合物的沉積導(dǎo)致 IV 膠原網(wǎng)絡(luò)的形成。巢蛋白將層黏連蛋白層和 IV 型膠原網(wǎng)絡(luò)相連接，也有些文獻(xiàn)報(bào)道層黏連蛋白和 IV 型膠原網(wǎng)絡(luò)可以直接相互連接。構(gòu)成基底膜的其它成分與層黏連蛋白和 IV 膠原網(wǎng)絡(luò)相連接共同組成細(xì)胞基底外側(cè)的基底膜。TypeIVcollagen：IV 型膠原蛋白；Nidogen：巢蛋白；Fibulin：纖連蛋白；Perlecan：基底膜蛋白多糖；Laminins：層黏連蛋白；Receptor：受體[3]。Deposition of this polymer leads to association with type IV collagen network.Nidogen/entactin bridges the laminin polymer and the type IV collagen network, although somestudies have indicated that direct interaction between the laminin polymer and type IV collagennetwork is possible. The other components of the BM interact with the laminin polymer and thetype IV collagen network to organize a functional BM on the basolateral aspect of cells[3].作為腫瘤微環(huán)境的重要組成成分，細(xì)胞外基質(zhì)在乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用。（1）由于 90%的細(xì)胞外基質(zhì)是由膠原構(gòu)成的，乳腺癌中最明顯的細(xì)胞外基質(zhì)改變就是膠原沉積增多[8]。膠原表達(dá)及沉積的增多與乳腺組織硬度及癌癥發(fā)展密切相關(guān)[9]。Liu 等人早在 1995 年就通過表達(dá) I 型膠原 α1 鏈膠原酶抵抗的基因工程小鼠（Col1α1tm1jae）與鼠乳腺腫瘤病毒啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的多瘤中間 T 抗原（MMTV-PyMT）轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌的發(fā)展中出現(xiàn) I 型膠原沉積增加，從而證明了 I 型膠原沉積和癌癥轉(zhuǎn)移的相關(guān)性[10]。I 型膠原與組織強(qiáng)度密切相關(guān)

的纖維蛋白折疊方式不同，膠原 XIII 同源三聚體在]。膠原 XIII 屬于 II 型跨膜蛋白，，NC1 為跨膜區(qū)，[38]。胞外區(qū)含有 RRRR 序列，可被內(nèi)切酶識別切割基質(zhì)中[42]。人CollagneXIIIα1蛋白由COL13A1（曾經(jīng)位于染色體 10q22，橫跨 140kb；而鼠膠原 XIIIα1 的0B4 上，橫跨 135kb[43]。人和鼠的 COLXIIIA1 基因 8 個(gè)堿基到 153 個(gè)堿基（人）或 144 個(gè)堿基（鼠）的剪接相互獨(dú)立，可影響 COL1、COL3、NC2 和 III 分子的大小及結(jié)構(gòu)域差異很大[40, 44, 45]。人類含0 個(gè)外顯子，可轉(zhuǎn)錄形成 754 個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白錄形成 596 個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白分子（圖 1.2）[44]器官中存在明顯差異[44]，目前報(bào)道的膠原 XIII 蛋白，說明在不同的組織器官中存在不同的剪接體[46-4
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9

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4 孫

本文編號：2627473