【摘要】：背景原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一,患者的預(yù)后較差,完全切除術(shù)后復(fù)發(fā)率仍然較高。有部分肝癌患者在腫瘤切除術(shù)后,3個月內(nèi)腫瘤再次復(fù)發(fā),這種復(fù)發(fā)病人預(yù)后差,我們稱之為早期復(fù)發(fā)。這可能是因為我們對肝癌的發(fā)生,發(fā)展機制了解較少。然而,隨著測序技術(shù)的突破性進展,非編碼RNA在肝癌中的異常表達,已經(jīng)證明是影響HCC的重要因素。長鏈非編碼RNA(long non-coding,lnc RNA)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA,基本不具有轉(zhuǎn)錄,編碼蛋白質(zhì)的功能,然而現(xiàn)在肝癌、肺癌、胃癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)lnc RNA異常表達,lnc RNA在腫瘤的生長,繁殖過程中可能起到重要的作用。目前l(fā)nc RNA在肝癌中的研究仍較少,且大部分lnc RNA調(diào)控機制,具體功能仍然不是很清楚,因此有尋找與肝癌相關(guān)異常表達的lnc RNA是極其重要的。本課題組應(yīng)用RNA-Seq檢測患者術(shù)后3個月內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)的肝癌組織和大于3年沒有復(fù)發(fā)的患者肝癌組織lnc RNA表達譜的差異,通過生物信息學(xué)篩選出與肝癌相關(guān)的lnc RNA,并進行功能和機制研究。目的本課題組通過RNA-Seq技術(shù)HCC術(shù)后早期復(fù)發(fā)病人腫瘤組織中篩選出有著顯著差異表達的長鏈非編碼RNA,探討該長鏈非編碼RNA在肝癌早期復(fù)發(fā)中的生物學(xué)功能及其調(diào)控機制。方法1、利用RNA-Seq技術(shù)檢測3例3個月內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)的肝癌組織和大于3年沒有復(fù)發(fā)的患者肝癌組織lnc RNA表達譜的差異,從表達水平、lnc RNA長度、數(shù)據(jù)庫完整lnc RNA序列、GO富集及KEGG pathway分析等方面篩選與肝癌相關(guān)的差異表達的lnc RNA,利用實時定量PCR(q RT-PCR)在肝癌細胞系和組織中驗證部分差異表達的lnc RNA,最后確定SNHG16為后續(xù)研究對象。2、FISH實驗定位SNHG16在細胞中的表達位置3、收集20例行肝癌切除術(shù)患者的早期復(fù)發(fā)的肝癌組織和對應(yīng)的癌旁組織,采用q RT-PCR方法檢測SNHG16的表達情況。4、收集102例行肝癌切除術(shù)患者的肝癌組織分析SNHG16表達情況與患者臨床病理特征及患者預(yù)后的關(guān)系。5、SNHG16靶基因的預(yù)測、驗證及功能研究:結(jié)合基因定位分析和生物信息預(yù)測,推測SNHG16可能與mi R-17-5p競爭性調(diào)節(jié)P62,并采用熒光素酶實驗報告驗證P62,mi R-17-5p與SNHG16之間的關(guān)系。6、SNHG16調(diào)控的分子機制研究:利用q RT-PCR、Western-blot、檢測m TOR通路。結(jié)果1、與3年沒復(fù)發(fā)的腫瘤組織相比,選取在3月內(nèi)復(fù)發(fā)的肝癌組織中同時高或低水平表達且2倍以上變化的lnc RNA,認為其差異表達有意義。通過生物信息學(xué)分析顯示這些差異表達的lnc RNA與細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期等相關(guān)基因有關(guān),部分還可能參與m TOR、NF-KB等信號通路調(diào)節(jié)。2、通過測序和組織篩選,我們發(fā)現(xiàn)lnc RNA SNHG16,其在早期復(fù)發(fā)的肝癌組織中均高表達,經(jīng)q RT-PCR驗證,lnc RNA SNHG16在肝癌細胞和早期復(fù)發(fā)肝癌組織中同時上調(diào)表達。SNHG16過表達與BCLC分期與腫瘤數(shù)目顯著相關(guān),Kaplan-Meier分析示SNHG16高表達與患者低生存率和高的腫瘤復(fù)發(fā)率有關(guān)。4、FISH定位分析發(fā)現(xiàn)SNHG16主要位于細胞質(zhì)中表達,少量在細胞核中表達。5、熒光素酶實驗報告結(jié)果表明SNHG16通過ce RNA機制競爭性結(jié)合mi R-17b-5p,調(diào)控P62的表達。6、q RT-PCR/Western-blot示SNHG16表達上調(diào)后,P62,P-m TOR顯著上調(diào),SNHG16表達下調(diào)后P62,P-m TOR下調(diào)。結(jié)論1、通過RNA-Seq,我們發(fā)現(xiàn)lnc RNA SNHG16,其在肝癌細胞及早期復(fù)發(fā)肝癌組織中均高表達,SNHG16的表達與肝癌患者的病理特征相關(guān),且可預(yù)測肝癌患者預(yù)后。2、SNHG16通過ce RNA競爭機制調(diào)控mi RNA-17b-5p調(diào)控靶基因P62的表達,并激活下游m TOR通路促進肝癌細胞增殖,侵襲。因此,肝癌中可能存在SNHG16-P62-m TOR的調(diào)控機制,通過影響細胞增殖與凋亡促進肝癌的發(fā)生發(fā)展,這將為日后深入研究肝癌分子機制及臨床治療提供新思路。
【圖文】：

Fig 8. The luciferase report assay in Huh-7 cells.圖 8. Huh-7細胞中熒光素酶報告。2.8. P62影響mTOR通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)2.8.1 生物信息學(xué)分析本研究前期通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SNHG16可能可以通過調(diào)節(jié)影響HCC中的mTOR通路，我們通過WB和PCR，，從蛋白和mRNA層Huh-7細胞中分析mTOR通路的激活情況。2.8.2 WB驗證WB實驗顯示：過表達的SNHG16相對NC有著更高的P62, mTOR, P
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 覃宏貴;PD-1、PD-L1在HCC組織中的表達和HCC組織中CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞浸潤程度及三者與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2017年

本文編號：2623888