【摘要】：聲動(dòng)力療法(SonodynamicTherapy,SDT)是一種新型的癌癥治療方法,他的基本原理與光動(dòng)力治療相似,利用聲敏劑可特異性濃聚在腫瘤組織的特性,超聲能使組織中的氧活化為單態(tài)氧,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。但是值得一提的是,跟光動(dòng)力治療(Photodynamic Therapy,PDT)激光對(duì)組織的穿透力不同,超聲可以深入到組織中,這就為使用聲動(dòng)力治療深部腫瘤組織提供了可能性。近來(lái)有研究報(bào)道PDT治療腫瘤具有腫瘤疫苗的特性,而SDT的作用機(jī)制與PDT相似,因此我們假設(shè),SDT也可以作為一種癌癥疫苗有效地發(fā)揮作用。因此,我們制定了一種治療策略,探討SDT能否消除原發(fā)性腫瘤,抑制轉(zhuǎn)移,防止腫瘤復(fù)發(fā)。目的:探討聲動(dòng)力(SDT)治療肝癌小鼠的免疫學(xué)機(jī)制。方法:使用正交設(shè)計(jì)對(duì)聲敏劑濃度、超聲強(qiáng)度、超聲頻度及照射時(shí)間四因素三水平進(jìn)行分組,共分為9組。采用MTT實(shí)驗(yàn)法測(cè)定細(xì)胞生存率,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定腫瘤細(xì)胞的凋亡率及流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定活性氧釋放量來(lái)選擇最佳參數(shù)組合。然后使用最佳參數(shù)組合,探討聲動(dòng)力治療的免疫效應(yīng)。采用免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)體外培養(yǎng)的H22腫瘤細(xì)胞表面的鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin,CRT)進(jìn)行測(cè)定:建立H22小鼠腫瘤模型觀察SDT對(duì)H22小鼠腫瘤大小和對(duì)遠(yuǎn)處(遠(yuǎn)隔)腫瘤的抑制作用。使用ELISA測(cè)定各組血清IL-2、IFN-γ和IL-10水平。用免疫組化檢測(cè)CD4、CD8、CD68、CD163、FOXP3等標(biāo)志在腫瘤組織中的表達(dá)情況。使用LDH釋放實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估處理后小鼠脾細(xì)胞對(duì)H22和S180腫瘤細(xì)胞特異性殺傷能力及遠(yuǎn)處腫瘤的免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)聲動(dòng)力引發(fā)的免疫特異性。結(jié)果:MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:聲動(dòng)力療效最好的參數(shù)組合是A2、B2、C3和D3;流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示:聲動(dòng)力療效最好的參數(shù)組合是A3、B3、C1、D3;流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定活性氧釋放量結(jié)果示:HPD為20μg/ml時(shí),聲動(dòng)力產(chǎn)生的活性氧濃度最高,殺傷腫瘤細(xì)胞的能力最強(qiáng),其余因素個(gè)水平無(wú)顯著特異性。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:聲動(dòng)力最佳組合為超聲強(qiáng)度為1.0 W/cm2,聲敏劑濃度為20μg/ml,照射時(shí)間為30分鐘。由于超聲頻率三水平之間無(wú)明顯差異,因此對(duì)于超聲頻率在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們選擇使用50%。單次聲動(dòng)力照射治療,療效較弱,因此我們選擇通過(guò)增加連續(xù)照射次數(shù),即延續(xù)照射時(shí)間,來(lái)達(dá)到增強(qiáng)療效的效果。結(jié)果顯示在連續(xù)輻照4周期(即照射時(shí)間為2小時(shí)),腫瘤大小明顯小于其他組(P = 0.001)。因此,聲動(dòng)力在本實(shí)驗(yàn)中的參數(shù)組合最后確定為:超聲強(qiáng)度為1.0 W/cm2,聲敏劑濃度為20μg/ml,超聲頻度為50%,照射時(shí)間為2h,并將應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。探討聲動(dòng)力治療的免疫效應(yīng)結(jié)果顯示:流式細(xì)胞技術(shù)和免疫熒光染色測(cè)定結(jié)果顯示:聲動(dòng)力組(SDT)處理的H22細(xì)胞表面檢測(cè)到較單純超聲組、單純聲敏劑組及對(duì)照組有更顯著的CRT表達(dá)。聲動(dòng)力組(SDT)對(duì)皮下腫瘤可觀察到明顯的抑制生長(zhǎng)的作用,隨時(shí)間延長(zhǎng)腫瘤逐漸變小,并且對(duì)遠(yuǎn)處(遠(yuǎn)隔)腫瘤的抑制作用。同時(shí),6周期聲動(dòng)力治療效果較4周期明顯,因此后續(xù)小鼠實(shí)驗(yàn)均選用6周期聲動(dòng)力治療。6周期聲動(dòng)力治療后,小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平明顯高于其余三組的相應(yīng)細(xì)胞因子水平(P0.0001);相反,IL-10水平明顯低于其余三組水平(P0.0001)。在SDT的腫瘤組織中CD4、CD8、CD68的表達(dá)水平較高,CD163、FOXP3的表達(dá)水平較低。單因素方差分析顯示:組間差異顯著(CD4(P0.001);CD8(P0.001);CD68(P0.001);CD163(P = 0.005);和 FOXP3(P0.001))。LDH 釋放實(shí)驗(yàn)顯示結(jié)論:對(duì)于H22腫瘤細(xì)胞,D組的脾細(xì)胞殺傷能力明顯高于其余三組(P0.0001),在效靶比為100:1(P0.0001)時(shí),殺傷能力最強(qiáng)。而相反,對(duì)于S180,聲動(dòng)力組的脾細(xì)胞的殺傷能力與其他組沒(méi)有明顯差異。小鼠的遠(yuǎn)處腫瘤組織進(jìn)行免疫組化結(jié)果顯示,聲動(dòng)力組的小鼠中組織中出現(xiàn)明顯的CD4,CD8T細(xì)胞的浸潤(rùn)。Image-pro+6.0對(duì)細(xì)胞的免疫陽(yáng)性進(jìn)行了定量分析顯示:各組間差異顯著(CD4 P0.001;CD8P0.001)。結(jié)論:SDT能產(chǎn)生有效的癌癥疫苗的潛力,可以抑制原發(fā)性和遠(yuǎn)隔的腫瘤生長(zhǎng),值得做進(jìn)一步深入研究。
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甚至導(dǎo)致其壞死，被認(rèn)為聲動(dòng)力殺傷腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制之一。因此，我們用逡逑ＤＣＦＨ－ＤＡ染色法對(duì)ＲＯＳ的產(chǎn)生進(jìn)行分析，并使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定。與陰逡逑性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Ｒ０Ｓ水平升高（圖２－３邋）。單因素方差分析結(jié)果顯示組間逡逑差異顯著（Ｐ＝0．00４）。單因素分析表明，Ｒ０Ｓ的產(chǎn)生主要是由ＷＤ濃度決定的逡逑（Ｐ＜０．００１）。對(duì)于ＨＰＤ濃度，Ａ３產(chǎn)生的活性氧濃度最高（ＲＯＳ＝７４．５０８），Ａ１水逡逑平分別于Ａ２和Ａ３水平均存在顯著性差異，而Ａ２和Ａ３之間沒(méi)有顯著差異。逡逑因此，ＨＴＯ為２０（＾／１１１１時(shí)，聲動(dòng)力產(chǎn)生的活性氧濃度最高，，殺傷腫瘤細(xì)胞的能逡逑力最強(qiáng)。逡逑１６逡逑

圖２－３邋ＲＯＳ水平使用ＤＣＦＨ－ＤＡ測(cè)量
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 張震;夏春義;劉云會(huì);薛一雪;;低頻超聲選擇性開(kāi)放血腫瘤屏障的實(shí)驗(yàn)性研究[J];中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)雜志;2008年07期

本文編號(hào)：2618194