【摘要】：目的:在腫瘤微環(huán)境中,存在某些免疫負性調控分子,特別是PD-L1分子,不僅可以促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展,還參與了腫瘤免疫逃逸。MUC1作為一種跨膜糖蛋白在乳腺癌組織中高表達,參與多種腫瘤的免疫反應。近期的研究已證實,NSCLC(非小細胞性肺癌)中,靶向MUC1后PD-L1分子的表達下調。本課題旨在針對乳腺癌中MUC1對PD-L1分子表達調控的研究,為后續(xù)研究PD-L1分子的表達調控奠定一定的實驗基礎。方法:1、PD-L1及MUC1在乳腺組織的表達情況。從臨床收集14例乳腺癌患者的病理組織(乳腺癌組織及癌旁正常組織),將其作為實驗標本,并隨機分為試驗組和對照組。分別使用免疫組化方法染色,標記PD-L1及MUC1分子,根據(jù)陽性分子體積占比進行半定量計算,統(tǒng)計PD-L1及MUC1的表達情況以分析MUC1和PD-L1在乳腺癌標本中的相關性。2、篩選PD-L1、MUC1陽性表達人乳腺癌細胞株。通過Western Blot(WB)和流式細胞術(Flow Cytometry,FCM)檢測人乳腺癌細胞株(MX-1,SKBR3,MDA-MB231、MCF-7、HCC1937)中MUC1、PD-L1蛋白表達情況,篩選出PD-L1和MUC1均表達的細胞株進行后續(xù)實驗。3、過表達MUC1重組載體及靶向MUC1重組慢病毒載體的構建。PCR擴增出MUC1-mRNA序列同pEX-1載體相連接,構建pEX-1-MUC1的重組質粒;針對MUC1-mRNA序列設計shRNA引物,進一步退火,連接,慢病毒包被,構建靶向MUC1的shRNA-MUC1重組慢病毒。4、體外初步驗證MUC1對PD-L1的表達調控。對構建完成后的pEX-1-MUC1重組質粒及shRNA-MUC1重組慢病毒分別轉染及侵襲上述篩選出的乳腺癌細胞株,利用q-PCR(Real Time quantitative PCR,RT-qPCR)、WB及流式細胞技術檢測MUC1不同處理后,PD-L1的表達情況。5、MUC1對乳腺癌細胞PD-L1調控機制的初步探討。將PD-L1啟動子區(qū)目的DNA序列同熒光素酶報告基因載體pGL3-Basic連接,構建人PD-L1啟動子雙熒光素酶報告系統(tǒng),再分別轉染處理前后的乳腺癌細胞,利用雙熒光素酶活性報告系統(tǒng)原理檢測啟動子活性強弱;用NF-kB-p65通路抑制劑BAY-8075處理細胞后,比較處理前后細胞啟動子活性強弱。結果:1、臨床乳腺癌標本的組化顯示MUC1和PD-L1的表達存在正相關性;2、成功篩選出PD-L1及MUC1陽性的人乳腺癌細胞株(MD-MBA231,MX-1,SKBR3);3、成功構建了MUC1過表達重組載體(pEX-1-MUC1)及靶向MUC1的慢病毒載體(shRNA-MUC1);4、qPCR和WB結果均顯示,乳腺細胞株MB231在過表達MUC1后,相應的PD-L1其mRNA、蛋白水平均較對照組表達量上調;三株乳腺癌細胞株(MB231,MX-1,SKBR3)在靶向MUC1處理后,PD-L1表達量下調;5、雙熒光素酶活性驗證實驗中,乳腺細胞株MB231在過表達MUC1后,相應的PD-L1啟動子活性較對照組升高;三株乳腺癌細胞株(MB231,MX-1,SKBR3)在靶向MUC1處理后,PD-L1啟動子活性與對照組相比均不同程度降低;三組乳腺癌細胞在BAY作用后其啟動子活性均低于未處理組。結論:在人乳腺癌細胞中,MUC1可正向調節(jié)PD-L1的表達,并且可能通過NF-k B通路來影響PD-L1啟動子活性從而起到對PD-L1的表達調控作用。
【圖文】：

Biogps網站分析MUC1及PD-L1在人體組織中基因的表達情況

圖 1.2 GEPIA 網站分析 MUC1 和 PD-L1 在人乳腺組織中蛋白的表達情況Figure1.2 The expression of MUC1and PD-L1 in human mammary tissue analyzed throughGEPIA1.2.2 免疫組織化學法檢測乳腺癌中 MUC1 及 PD-L1 在乳腺癌標本中的表達免疫組織化學法對乳腺癌細胞膜表面進行抗體染色后，通過對抗體著色部分進行面積評定，根據(jù)染色面積占比情況區(qū)分陽性和陰性。結果顯示，經 MUC單抗處理過的乳腺癌組織染色清晰，著色以細胞膜處為主，呈深棕色，陽性細胞數(shù)目極多，，分布比較集中；經 PD-L1 單抗處理過的乳腺癌組織著色以細胞膜處為主，呈棕色，分布相對彌散，如圖 1.3 所示，實驗的統(tǒng)計結果如表 1.2 所示。
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9

【參考文獻】

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1 李霓;鄭榮壽;張思維;鄒小農;曾紅梅;代珍;陳萬青;;中國城鄉(xiāng)女性乳腺癌發(fā)病趨勢分析和預測[J];中華預防醫(yī)學雜志;2012年08期

2 Yaron Niv;;Microsatellite instability and MLH1 promoter hypermethylation in colorectal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2007年12期

本文編號：2613535