【摘要】：腫瘤抑制基因p53在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮著極其重要的作用。作為突變頻率最高的抑癌基因之一,p53在50%以上的人類腫瘤中發(fā)生突變,并在腫瘤細胞內(nèi)維持較高水平。Rap2b是Ras癌基因超家族和p53的新靶基因,在大多數(shù)腫瘤細胞中高表達。我們推測,腫瘤細胞中較高水平的突變p53蛋白仍在一定程度上保留了對Rap2b的誘導能力,因而表達較高水平的Rap2b,從而促進腫瘤細胞的存活。本研究旨在探討Rap2b在p53突變的腫瘤細胞中的功能、Rap2b表達水平與p53突變之間的關(guān)系及其可能的分子基礎(chǔ),為深入理解Rap2b和p53在腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展過程中的作用提供重要實驗依據(jù)。首先,本研究參照UMD數(shù)據(jù)庫中各種腫瘤的p53熱點突變資料,選擇46個突變位點和突變方式,設計一系列p53突變引物構(gòu)建p53突變體,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒至HCT116(p53-/-)細胞,并利用免疫印跡法檢測突變體的表達情況。結(jié)果顯示,31個p53突變體在該細胞中存在高水平表達。接著,選取能成功表達p53突變體的質(zhì)粒包裝慢病毒,感染人結(jié)直腸癌細胞HCT116(p53-/-),經(jīng)抗生素篩選后,獲得穩(wěn)定表達各種p53突變體的細胞株。利用免疫印跡法檢測Rap2b和p53的表達水平,以揭示不同p53突變體與Rap2b表達水平之間的關(guān)系。結(jié)果表明,p53某些位點的突變能提高腫瘤細胞內(nèi)Rap2b的蛋白水平。然后,選取兩個代表性的p53突變(p53R175H和p53R273H)細胞株,穩(wěn)定敲低細胞內(nèi)Rap2b的表達水平,觀察Rap2b的敲低對p53突變腫瘤細胞株生長速率、遷移能力、致瘤性、阿霉素處理前后細胞周期和細胞凋亡的影響。結(jié)果表明,Rap2b敲低后p53突變腫瘤細胞的生長速率、致瘤性和細胞遷移能力顯著降低,但是對細胞凋亡和細胞周期沒有明顯影響。最后,為探明p53突變腫瘤細胞表達高水平Rap2b蛋白的原因,我們研究了在p53野生型和突變型腫瘤細胞中調(diào)控Rap2b表達方式的差異。通過用Nutlin-3處理p53野生型及突變型腫瘤細胞,并在撤除Nutlin-3后的不同時間點用免疫印跡法檢測p53和Rap2b的蛋白水平,我們發(fā)現(xiàn)在p53突變的腫瘤細胞中,p53突變體蛋白在Nutlin-3撤除后仍在較長時間范圍內(nèi)維持較高水平,并且p53在不同程度上丟失了對某些靶基因如p21的誘導作用,但仍然能誘導一些靶基因如Rap2b、Hdm2、Bax和Puma等的表達。我們還通過Pulldown實驗發(fā)現(xiàn),p53的突變嚴重阻礙p53與Rap2b的直接結(jié)合。綜上所述,本研究揭示p53突變通過顯著提升腫瘤細胞中p53突變體蛋白的穩(wěn)定性,使腫瘤細胞中的Rap2b蛋白維持在較高水平,從而促進腫瘤細胞的生存。這一發(fā)現(xiàn)對于制定有效的人類癌癥治療策略具有重要意義。
【圖文】：

超過９５％的錯義突變發(fā)生在ＤＢＤ區(qū)，盡管該區(qū)域的每個氨基酸都能發(fā)生突變，但是逡逑以下幾個位點的突變在癌癥中則相對頻繁，并與癌癥發(fā)生緊密關(guān)聯(lián)，因而被稱之為熱點逡逑突變，這幾個突變位點分別是：Ｒ１７５、Ｇ２４５、Ｒ２４８、Ｒ２４９、Ｒ２７３、Ｒ２８２邋（圖１－１）。逡逑ｐ５３突變大體上可以分為兩種：移除了基本的ＤＮＡ作用位點的ＤＮＡ接觸突變（致使ｐ５３逡逑與ＤＮＡ結(jié)合的能力減弱）和擾亂了邋ｐ５３功能域的結(jié)構(gòu)突變，最終減弱了它的動力學和熱逡逑力學穩(wěn)定性（Ｃｈｏ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋１９９４；邋Ｆｒｉｅｄｌｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００３）。逡逑１．２．２突變ｐ５３特性逡逑１．２．２．１突變ｐ５３的半衰其月逡逑突變ｐ５３為了執(zhí)行其功能，在癌細胞中的高水平表達是其功能性獲得的重要一步，其逡逑半衰期也得到普遍的延長（１－２４ｈ），而野生型ｐ５３蛋白的半衰期則被嚴格控制，通常只有１０逡逑ｍｉｎ左右。對于這一現(xiàn)象，有研宄發(fā)現(xiàn)，癌細胞中ｐ５３突變蛋白在細胞中的定位更加廣泛逡逑（Ｓｏｕｓｓｉ，邋２００５；邋Ｍｏｒｓｅｌｌｉ邋ｅｔａｌ．，邋２００８），這表明ｐ５３突變蛋白在核質(zhì)間的穿梭能力降低，使ｐ５３逡逑突變蛋白被ＨＤＭ２泛素化修飾并降解的機會降低。另有研究表明，在ｐ５３突變的細胞中，逡逑ｐ５３與ＨＤＭ２／ＭＤＭ２這一負反饋機制受到限制（Ｙｕｅｅｔａｌ．

（Ｍａｒｉｄｏｎｎｅａｕ邋ａｎｄ邋Ｄｅ，邋１９９２），多個研究均己證明Ｒａｐ２ｂ在細胞癌變時表達量增加（Ｄｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２０１５；邋Ｚｈａｎｇ邋ｅｔａｌ．，邋２００７），進而推定該蛋白可能加速細胞致瘤并是一個癌基因。另外，最逡逑新的ＧＥＰ丨Ａ數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計結(jié)果顯示Ｒａｐ２ｂ在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達（圖１－４）。逡逑３0邋１逡逑＾２５邋■邐■ＴＵｍ0ｒ逡逑■邋Ｎｏｒｍａｌ逡逑ｍ逡逑Ｚ邋２０邋－逡逑ｌ１５邐Ｉ逡逑圖１－４邋Ｒａｐ２ｂ在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達。數(shù)據(jù)來自最新ＧＥＰＩＡ數(shù)據(jù)庫。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｒａｐ２ｂ邋ｉｓ邋ｈｉｇｈｌｙ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｉｎ邋ａ邋ｖａｒｉｅｔｙ邋ｏｆ邋ｔｕｍｏｒ邋ｔｉｓｓｕｅｓ．邋Ｔｈｅ邋ｄａｔａ邋ｃｏｍｅ邋ｆｒｏｍ邋ｔｈｅ邋ｌａｔｅｓｔ邋ＧＥＰＩＡ逡逑ｄａｔａｂａｓｅ．逡逑Ｒａｐ２ｂ作為一個�。牵裕校幔螅澹�，在鳥苷酸交換因子（ＧＥＦ）作用下（ＧｕｉｄｅｔｔｉａｎｄＴｏｒｔｉ，逡逑２０１２），１＾卩２１？通過結(jié)合0�。慷せ�，而在0丁？＆５６激活蛋白（0八？）作用下（0代（；（＾１３１．，逡逑２００６），邋Ｒａｐ２ｂ邋結(jié)合邋ＧＤＰ邋而失活。ＧＥＦ邋主要包括邋ＰＤＺ－ＧＥＦｓ、Ｅｐａｃｌ、ＣａｌＤＡＧ－ＧＥＦ、逡逑Ｃｒｋ、Ｃ３Ｇ等，ＧＡＰ主要包括ＲａｐＧＡＰ、Ｅ６ＴＰ１、ＳＩＰＡ１。在許多胞外激活劑及胞內(nèi)信號逡逑
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R730.2

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊京舉;;細胞癌變拾遺[J];中學生物教學;2012年Z1期

2 ;三種基因即可使人體細胞癌變[J];中國腫瘤;1999年12期

3 張建明,柯楊;細胞癌變的遺傳模型研究回顧與展望[J];國外醫(yī)學.遺傳學分冊;1997年01期

4 張友尚;;細胞的生長與癌變,生長因子與癌基因[J];生命的化學(中國生物化學會通訊);1987年01期

5 李文鑫;;c-myc和c-ras基因在正常、化學轉(zhuǎn)化和腫瘤細胞中的表達[J];武漢大學學報(自然科學版);1987年02期

6 李桂源;潘世[

本文編號：2611482