【摘要】：目的:構(gòu)建基于肝細(xì)胞外基質(zhì)(Liver Biomatrix,LBM)與乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞共培養(yǎng)的三維體外乳腺癌模型;研究LBM對不同培養(yǎng)條件下乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖和對化療藥物敏感性的影響;探索LBM與腫瘤細(xì)胞粘附以及腫瘤干細(xì)胞干性維持介導(dǎo)腫瘤耐藥的機制。方法:采用脫氧膽酸鈉(SDC)灌流法獲取SD大鼠LBM,采用液滴重疊法與MDA-MB-231細(xì)胞共培養(yǎng)構(gòu)建LBM三維乳腺癌細(xì)胞球體外培養(yǎng)模型。采用alamar blue法檢測乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞在2D、2D+LBM、3D及3D+LBM培養(yǎng)條件下的增殖情況,以及對常用化療藥物紫杉醇(PTX)、多西他賽(DTX)、表柔比星(EPI)、順鉑(DDP)、氟尿嘧啶(5-Fu)、環(huán)磷酰胺(CTX)、吉西他濱(GEM)、長春瑞濱(NVB)、依托泊苷(VP-16)的敏感性。使用流式細(xì)胞儀檢測在2D、2D+LBM、3D及3D+LBM培養(yǎng)條件下MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)EPI含量的陽性細(xì)胞率和中位熒光強度,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)EPI的熒光強度。用RT-PCR方法分別檢測乳腺癌細(xì)胞在2D、2D+LBM、3D及3D+LBM培養(yǎng)條件下,耐藥基因(Bcl-2、MRP2、MRP3、MDR1)、凋亡基因(Bax、Caspase-3)、細(xì)胞膜表面LBM受體基因(67KDLR、ITGB1)、粘附耐藥信號通路基因(FAK、AKT、FOXO3、NF-κβ、Survivin)、以及腫瘤干細(xì)胞干性維持信號通路基因(LEF-1、FN1、SNAIL1/2、SOX9、TGF-β)的表達情況,對比不同培養(yǎng)條件下的基因表達差異。結(jié)果:1、SD大鼠肝臟經(jīng)脫細(xì)胞后,經(jīng)HE染色和免疫組化染色顯示肝臟細(xì)胞成份脫失,獲取肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(LBM)成份。MDA-MB-231細(xì)胞與LBM共培養(yǎng)構(gòu)建三維腫瘤細(xì)胞球體外培養(yǎng)模型,在2D、2D+LBM、3D及3D+LBM條件下培養(yǎng),第4天時的增值活力分別為第1天的6.8、8.4、1.4和2.1倍。MDA-MB-231細(xì)胞的3D和3D+LBM腫瘤細(xì)胞球經(jīng)石蠟切片HE染色,細(xì)胞均呈現(xiàn)類圓形,3D+LBM培養(yǎng)的細(xì)胞球更為致密。2、研究常用化療藥物對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的敏感性,檢測其IC20值(μg/m L),紫杉類化療藥PTX、DTX作用于2D+LBM細(xì)胞的IC20值(0.87、1.5)低于2D(1.3、2.1),其余化療藥物(EPI、DDP、5-Fu、CTX、GEM、NVB、VP-16)的在2D+LBM條件下IC20值均高于2D;在3D+LBM條件下所有化療藥物均明顯高于2D+LBM。檢測MDA-MB-231細(xì)胞對EPI的內(nèi)吞與外排,內(nèi)吞10min、30min和60min,2D+LBM細(xì)胞的EPI陽性細(xì)胞率(27%、36%和68%)低于2D(46%、62%和85%),3D(45%、61%和84%)與2D相似,3D+LBM(25%、32%和43%)最低。2D+LBM的EPI中位熒光強度(716、942和1438)低于2D(1091、1356和1807),3D(891、1108和1692)與2D相似,3D+LBM(479、281和462)最低,表明3D+LBM時細(xì)胞內(nèi)吞EPI量最低,且隨著作用時間的延長,EPI熒光強度越強。EPI外排時間為0h、1h、2h和4h時,2D+LBM的EPI陽性細(xì)胞率(45%、26%、20%和17%)低于2D(65%、55%、39%和36%),3D(63%、45%、21%和19%)與2D相似,3D+LBM(43%、23%、16%和13%)最低;檢測細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下、不同外排時間時細(xì)胞中EPI中位熒光強度,2D+LBM(986、733、630和618)低于2D(1252、1117、922和869),3D(1022、914、496和468)低于2D,3D+LBM(806、599、494和467)最低,結(jié)果提示,3D+LBM時細(xì)胞外排的EPI量最多,隨著外排時間延長,EPI的熒光強度越弱。3、使用RT-PCR檢測和對比乳腺癌耐藥相關(guān)基因的表達情況,加入LBM共培養(yǎng)后,無論2D或3D培養(yǎng)條件下,耐藥基因Bcl-2、MRP2、MDR1表達上調(diào),凋亡基因Bax、Caspase-3較2D表達下調(diào);粘附耐藥信號通路基因FAK、AKT、FOXO3、NF-κβ、Survivin表達上調(diào);在2D培養(yǎng)條件下加入LBM時,細(xì)胞膜表面LBM受體基因(67KDLR和ITGB1)表達上調(diào);腫瘤干細(xì)胞干性維持通路基因LEF-1、FN1、SOX9、TGF-β表達上調(diào)。結(jié)論:1、SD大鼠LBM與乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞共培養(yǎng)可以形成3D腫瘤細(xì)胞球,LBM可以促進MDA-MB-231細(xì)胞的增殖,且3D培養(yǎng)較2D培養(yǎng)增殖速率慢。2、對于化療藥物的抗腫瘤活性測試發(fā)現(xiàn),3D培養(yǎng)條件下對化療藥物的IC20明顯高于2D培養(yǎng);相較于2D、2D+LBM與3D培養(yǎng),3D+LBM培養(yǎng)時的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更高的化療藥物耐受性。LBM可以促進MDA-MB-231細(xì)胞對EPI的內(nèi)吞減少,外排增加。3、LBM和MDA-MB-231細(xì)胞共培養(yǎng)時可以促進粘附受體基因和耐藥基因的表達,抑制凋亡基因表達,促進粘附耐藥相關(guān)信號通路基因和腫瘤干細(xì)胞干性維持相關(guān)通路基因的表達。本研究提示MDA-MB-231細(xì)胞與LBM共培養(yǎng)體外三維模型更符合體內(nèi)生長環(huán)境,LBM促進MDA-MB-231細(xì)胞產(chǎn)生耐藥,研究耐藥機制可能和粘著斑激酶FAK-AKT通路中的(FAK、FOXO3、NF-κβ、Survivin)有關(guān),并和TGF-β信號通路中的(LEF-1、FN1、SOX9、TGF-β)相關(guān)。
【圖文】：

圖 1 SD 大鼠脫細(xì)胞前后大體照片（A）。SD 大鼠肝臟和脫細(xì)胞外基質(zhì) DAPI 染（B）。SD 大鼠肝臟脫細(xì)胞外基質(zhì)（LBM）DNA 含量、GAGs 及膠原檢測（CSD 大鼠肝臟及脫細(xì)胞外基質(zhì) HE 染色、免疫組化染色（D）。Figure 1 General photo (A) before and after decellularization in SD rats. SD rat liverand acellular extracellular matrix (LBM) DAPI stained nucleus (B). Detection of DN22

SD 大鼠肝臟脫細(xì)胞后，肝臟細(xì)胞成分脫去，臟面由暗紅色變A)。將 SD 大鼠肝臟和 LBM 進行 DAPI 染核，發(fā)現(xiàn)經(jīng)脫細(xì)留，見圖 1(B)。通過檢測 DNA、GAGs 及膠原含量，進行 殘留較少，為脫細(xì)胞前 SD 大鼠肝臟的 6%，GAGs 及膠原保留，分別為未脫細(xì)胞肝臟的 21%和 83%，見圖 1(C)。 進行 HE 染色和免疫組化染色，也可發(fā)現(xiàn) LBM 相較脫細(xì)胞，肝臟脈管系統(tǒng)和肝臟細(xì)胞外基質(zhì)成份得到保留，硫酸乙HS）、層連蛋白（Laminin，LN）、纖連蛋白（Fibronectinen，Nid）、I 型膠原（Collagen I，C1）、III 型膠原（CollagCollagen IV，C4）、V 型膠原（Collagen V，，C5）、VI 型膠脫細(xì)胞前后均無明顯差異，見圖 1(D)。+LBM 培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞球的形態(tài)表征
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9

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本文編號：2607290