【摘要】：第一部分GRHL3和c-MYC在食管鱗癌組織中的表達及其臨床意義目的:研究食管鱗癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)患者鱗癌組織及癌旁組織中轉(zhuǎn)錄因子GRHL3(Grainyhead-like 3,GRHL3)和c-MYC的表達情況,并在基因水平和蛋白水平分析GRHL3和c-MYC表達水平之間的關(guān)系,分析GRHL3和c-MYC與ESCC患者臨床病理特征的關(guān)系。方法:1收集2015年6月至2016年9月在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院胸外科行腫瘤切除并經(jīng)病理證實的64例ESCC患者的ESCC組織和癌旁組織,將每例標本分為2份,按下述兩種方法處理:(1)置于液氮中,然后置于-80℃超低溫冰箱中貯存以備提取RNA;(2)以4%甲醛溶液固定以備制作組織蠟塊,用于免疫組化染色。2采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(quantificational real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)方法檢測ESCC組織、癌旁組織中GRHL3和c-MYC m RNA的表達水平,在基因水平分析其相關(guān)性。3應(yīng)用免疫組化方法檢測ESCC組織、癌旁組織中GRHL3和c-MYC蛋白表達水平,并在蛋白水平分析其相關(guān)性。4分析ESCC組織內(nèi)GRHL3和c-MYC蛋白表達水平與患者臨床特征關(guān)系。結(jié)果:1 ESCC組織中GRHL3 m RNA的表達水平顯著高于癌旁組織[(2.85±2.83)vs.(2.06±2.02),P0.01],ESCC組織中c-MYC m RNA的表達水平顯著高于癌旁組織(5.13±5.11 vs.2.03±2.00,P0.01)。GRHL3與c-MYC m RNA的表達水平呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P0.001)。2與癌旁組織相比,ESCC組織中GRHL3蛋白陽性表達水平均顯著升高(81.30%vs.25.00%,P0.001),ESCC組織中c-MYC蛋白陽性表達水平均顯著升高(42.20%vs.20.30%,P0.01)。ESCC組織中GRHL3蛋白表達和c-MYC蛋白表達呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P0.001)。該結(jié)果表明在ESCC患者GRHL3和c-MYC表達在基因水平和蛋白水平上是一致的。3 ESCC組織中GRHL3蛋白表達情況與腫瘤分化程度、侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)(P0.001;P=0.037;P=0.022;P=0.003),與患者性別、年齡無關(guān)(P=0.604;P=0.904);ESCC組織中c-MYC蛋白表達水平與腫瘤分化程度、侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)(P=0.019;P=0.023;P=0.005;P=0.001),與患者性別、年齡無關(guān)(P=0.403;P=0.747)。第二部分GRHL3對食管癌細胞惡性生物學行為的影響及其機制研究目的:研究GRHL3對食管鱗癌細胞惡性生物學行為的影響,并探討相關(guān)機制。方法:1應(yīng)用q RT-PCR方法檢測GRHL3在TE13、TE1、KYSE30、Eca109和KYSE170五種食管鱗狀細胞癌細胞株中的表達情況,篩選出GRHL3高表達的食管鱗癌細胞KYSE30。應(yīng)用RNA干擾(RNA interference,RNAi)方法敲低GRHL3 m RNA的表達,分為干擾組(si-GRHL3組),陰性對照組(NC-GRHL3組)及空白對照組(Con組),經(jīng)q RT-PCR和Western blot方法分別檢測3組細胞GRHL3在基因和蛋白水平的表達情況。2應(yīng)用MTS法、細胞克隆形成實驗、細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗檢測敲低GRHL3后KYSE30細胞增殖活性、遷移能力和侵襲能力的變化。3應(yīng)用流式細胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM)檢測敲低GRHL3后對KYSE30細胞細胞周期及凋亡的影響。4應(yīng)用免疫印跡法(Western blot)檢測敲低GRHL3后對KYSE30細胞遷移相關(guān)蛋白表達水平的影響。結(jié)果:1檢測TE13、TE1、KYSE30、Eca109和KYSE170五種人食管鱗癌細胞株GRHL3 m RNA的表達水平,篩選出GRHL3表達水平最高的KYSE30細胞,用于后續(xù)實驗。與NC-GRHL3組和Con組相比,si-GRHL3組KYSE30細胞中GRHL3基因和蛋白表達水平顯著降低(P0.05),說明已成功敲低GRHL3在KYSE30細胞中的表達。2細胞克隆形成實驗、MTS法檢測結(jié)果顯示,敲低GRHL3能夠抑制食管癌KYSE30細胞的克隆形成能力[(59.28士3.64)vs.(87.33士1.90)vs.(88.87士0.36),P0.05]及增殖活性[(0.87士0.01)、(1.22士0.03)、(1.37士0.25)vs.(1.10士0.01)、(1.89士0.09)、(2.10士0.09)vs.(1.14士0.04)、(1.93士0.01)、(2.23士0.05),P0.05)]。3細胞劃痕實驗結(jié)果顯示,劃痕12h和24h后,si-GRHL3組細胞遷移距離為(24.5±3.2 vs.55.4±4.8)μm,NC-GRHL3組細胞遷移距離為(59.3±3.6 vs.95.1±4.6)μm,Con組細胞遷移距離為(64.2±3.2 vs.92.3±3.5)μm。si-GRHL3組遷移距離在12h及24h后與NC-GRHL3組和Con組相比均明顯縮短,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),NC-GRHL3組和Con組相比無統(tǒng)計學意義(P0.05),說明GRHL3能夠影響KYSE30細胞的遷移能力。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示,si-GRHL3組、NC-GRHL3組和Con組穿膜細胞數(shù)分別為(50.26±4.37)vs.(120.00±4.01)vs.(129.38±5.20),si-GRHL3組穿膜細胞數(shù)較NC-GRHL3組和Con組均顯著降低(P0.05),兩者穿膜細胞數(shù)無統(tǒng)計學意義(P0.05),說明GRHL3敲低后能夠抑制KYSE30細胞的侵襲能力。4流式細胞術(shù)結(jié)果顯示:與NC-GRHL3組和Con組相比,si-GRHL3組細胞中DNA合成受到抑制,阻止si-GRHL3組細胞從G0/G1期進入S期,使G0/G1期百分比明顯增加[(66.64士1.31)%vs.(56.53士2.15)%vs.(55.97士1.36)%,P0.05]。敲低GRHL3后,si-GRHL3組KYSE30細胞的凋亡率與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。5 Western blot結(jié)果顯示,敲低GRHL3能夠促進E鈣粘蛋白(E-cadherin,E-cad)的表達(P0.05),降低N鈣粘蛋白(N-cadherin,N-cad)的表達(P0.05)。結(jié)論:1 ESCC患者組織中GRHL3和c-MYC呈高表達狀態(tài),與腫瘤分化程度、侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床病理分期相關(guān),與患者性別、年齡無關(guān)。2通過RNA干擾實驗證明GRHL3通過影響食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力及EMT促進食管癌的發(fā)生發(fā)展。
【圖文】：

HL3 基因和 c-MYC 基因在食管鱗癌組織和癌旁組織NA expressions of GRHL3 and c-MYC in tumor inoma tissues of ESCC patients Para: Para-carcinoma tiss1 vs. para-carcinoma tissues

20 GRHL3 蛋白在食管鱗癌組織和癌旁組織中的ion of GRHL3 protein in tumor tissues andC patients (SP, ×200) A: Positive staining of Gative staining of GRHL3 in para-carcinoma tisoma tissues;
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Danielle Queiroz Calcagno;Mariana Ferreira Leal;Paulo Pimentel Assumpo;Marília de Arruda Cardoso Smith;Rommel Rodríguez Burbano;;MYC and gastric adenocarcinoma carcinogenesis[J];World Journal of Gastroenterology;2008年39期

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本文編號：2579165