發(fā)布時間：2020-02-06 04:46

【摘要】：背景MicroRNA是指一系列長度估計在19-25個核苷酸的非編碼小分子RNA,在結(jié)構(gòu)上具有高度保守性,在功能上MicroRNA通過與目標mRNA的3’末端非翻譯區(qū)特異性結(jié)合【1】,進而引起目標MicroRNA的降解或者翻譯抑制。另外,MicroRNA的結(jié)合區(qū)域現(xiàn)在被證實不僅僅限于3'-UTR,在基因的5'-UTR、編碼區(qū)以及啟動子均發(fā)現(xiàn)有MicroRNA結(jié)合序列,這提示,MicroRNA和基因是一對多的關(guān)系,即一種miRNA可以調(diào)控多達上百種的目的基因。也正是通過這種作用,MicroRNAA參與調(diào)控包括細胞增殖,分化,衰老,凋亡在內(nèi)的多種細胞進程。甲狀腺癌是人類最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤,女性發(fā)病率明顯高于男性,而且近年來,不管是在我國還是北美地區(qū)都成為發(fā)展速度最快的腫瘤之一【2】,而在甲狀腺癌中,以甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)最為常見,幾乎占到所有甲狀腺癌的九成以上,而且通過規(guī)范的手術(shù)治療和術(shù)后治療,預后較好。自噬是細胞的一種在饑餓、能量代謝缺乏等應激狀況下發(fā)生自我吞噬進而獲取所需物質(zhì)來維持細胞基本生命活動的過程,它表現(xiàn)在細胞漿中出現(xiàn)大量包裹著蛋白質(zhì)(一般指長壽命蛋白,短壽命蛋白一般由蛋白酶體途徑消化降解)和細胞器的雙層膜性空泡結(jié)構(gòu)和溶酶體,對空泡內(nèi)成分的降解而轉(zhuǎn)變成為機體所需要的能量物質(zhì)【3】,通過降解胞內(nèi)蛋白,實現(xiàn)細胞本身的代謝需要,完成細胞器的轉(zhuǎn)化和更新,是維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要調(diào)節(jié)方式之一,并廣泛存在于生命進化的過程當中。細胞自噬與多種疾病的有著緊密的聯(lián)系,而腫瘤則是最早被發(fā)現(xiàn)與自噬相關(guān)的疾病之一【4】。在本課題的前期研究中,通過應用高通量的Micro RNA芯片篩選出了不同分期的甲狀腺乳頭狀癌組織和癌旁正常組織中具有差別性表達的Micro RNA時發(fā)現(xiàn),microRNA-146b-5p在早期和中晚期甲狀腺乳頭狀癌組織中均持續(xù)表達,而且其表達水平隨著腫瘤分期的上升而有升高的趨勢,這一證據(jù)提示該miRNA可能在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。在接下來的實驗中證實,過表達的microRNA-146b-5p能夠促進PTC細胞的增殖和侵襲能力。而本研究旨在通過對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞株使用慢病毒質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進而microRNA-146b-5p穩(wěn)定過表達和低表達的細胞株,之后利用透射電鏡,細胞免疫熒光技術(shù),Western blot技術(shù),探討microRNA-146b-5p對TPC-1細胞株自噬的影響。目的本實驗通過慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)獲得了mir-146b-5p高表達株,結(jié)合前期實驗得到的慢病毒侵染mir-146b-5p低表達株和空白TPC-1細胞株,旨在前期研究mir-146b-5p和TPC-1生物學行為關(guān)系的基礎(chǔ)上進一步研究mir-146b-5p和TPC-1細胞自噬的關(guān)系,得出結(jié)論后,為下一步研究自噬對TPC-1細胞生物學行為的影響,以及mir-146b-5p是否通過影響自噬進而影響TPC-1的生物學行為打下理論基礎(chǔ)。方法1.構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的mir-146b-5p過表達和低表達TPC-1細胞單克隆:(1)構(gòu)建mir-146b-5p過表達慢病毒質(zhì)粒(2)將mir-146b-5p過表達的慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入TPC-1細胞中,獲取mir-146b-5p穩(wěn)定過表達的細胞單克隆(3)由于前期實驗已經(jīng)取得microRNA-146b-5p低表達的TPC-1細胞株,故無需再進行轉(zhuǎn)染實驗2.研究microRNA-146b-5p對TPC-1細胞自噬的影響(1)分組:microRNA-146b-5p低表達組,TPC-1細胞組,miRNA-146b-5P過表達組(2)應用透射電鏡觀察各組細胞自噬小體的形成(3)應用細胞免疫熒光檢測各組細胞中LC3蛋白點狀聚集程度的變化(4)Western blot技術(shù)檢測各組細胞自噬標記物LC3-II水平(5)Western blot技術(shù)檢測自噬特異性底物p62/SQSTM1水平結(jié)果(1)透射電鏡下觀察microRNA-146b-5p上調(diào)組,正常組,下調(diào)組三組細胞的自噬情況,觀察到三組自噬程度有差異且自噬數(shù)量:下調(diào)組正常組上調(diào)組。(P0.05)(2)Western blot技術(shù)檢測各組細胞自噬標記物LC3-II/I水平有差異且從高到低依次是:microRNA-146b-5p下調(diào)組microRNA-146b-5p正常組microRNA-146b-5p上調(diào)組。(3)Western blot技術(shù)檢測自噬特異性底物p62/SQSTM1水平有差異且從低到高依次是:microRNA-146b-5p下調(diào)組microRNA-146b-5p正常組microRNA-146b-5p上調(diào)組。(4)應用細胞免疫熒光檢測各組細胞中LC3蛋白點狀聚集程度的熒光定量大小有差異且由高到低依次是:microRNA-146b-5p下調(diào)組microRNA-146b-5p正常組microRNA-146b-5p上調(diào)組結(jié)論本實驗通過透射電鏡觀察各組細胞自噬,Western blot技術(shù)檢測各組細胞自噬標記物LC3和自噬特異性底物p62/SQSTM1,細胞免疫熒光檢測各組細胞中LC3蛋白點狀聚集程度,以上實驗結(jié)果通過不同角度得出結(jié)論microRNA-146b-5能夠抑制TPC-1細胞的自噬,但是通過何種通路和靶基因產(chǎn)生這種作用以及能否通過這種作用和TPC-1的其他生物學特性能否聯(lián)系起來,尚待進一步研究。
【圖文】：

圖 2. miRNA-146b-5p 擴增曲線A1、A2 為 microRNA up 組的 miRNA-146b-5p 擴增曲線B1、B2 為 NC 組 miRNA-146b-5p 擴增曲線

34圖 5. Western blot 技術(shù)檢測各組細胞自噬標記物 LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ的水平以及 LC3-Ⅱ/Ⅰ的相對表達量A microRNA-146b-5p 正常組B microRNA-146b-5p 上調(diào)組C microRNA-146b-5p 下調(diào)組
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R736.1

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本文編號：2576802