【摘要】：蛋白質(zhì)去泛素化是指由去泛素化酶(deubiquitinases,DUBs)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)泛素化的負(fù)向調(diào)節(jié)過程。泛素和去泛素化調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)平衡,影響或者調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、等許多細(xì)胞生理病理過程。去泛素化酶通過水解底物蛋白質(zhì)上的泛素鏈調(diào)控蛋白的穩(wěn)定性,其活性直接影響細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的周轉(zhuǎn)率、活性、再生以及定位。P5091屬于泛素特異性蛋白酶7(ubiquitin-specific protease7,USP7)的噻吩類抑制劑,能高度特異性抑制USP7酶的活性,并且在多發(fā)性骨髓瘤的治療中顯示良好的抗腫瘤效果,對(duì)萬珂、多柔比星等耐藥的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞也具有抑制作用。此外,P5091抑制結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡。然而,P5091在食管鱗癌中的作用及分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本文主要通過體外實(shí)驗(yàn)來研究P5091在食管鱗癌中作用及機(jī)制,評(píng)價(jià)P5091對(duì)食管鱗癌增殖、凋亡、克隆形成等的作用,進(jìn)一步利用si RNA技術(shù)沉默靶基因的表達(dá)來反向驗(yàn)證P5091對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的作用,闡明P5091在食管鱗癌細(xì)胞中作用的具體分子機(jī)制,為食管鱗癌治療的新藥開發(fā)提供理論基礎(chǔ),為今后P5091應(yīng)用于臨床食管鱗癌的治療提供理論基礎(chǔ)。方法1.USP7在食管鱗癌中的表達(dá)水平檢測:取多株食管鱗癌細(xì)胞系和食管癌組織芯片進(jìn)行USP7蛋白水平的檢測,選取有代表性的細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞系:KYSE450、KYSE510、KYSE30。2.藥物濃度篩選:通過ATP依賴的熒光素酶細(xì)胞活性檢測來計(jì)算在不同細(xì)胞系中P5091的IC50值,從而確定不同細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)藥物濃度。3.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)圖片分析:評(píng)價(jià)不同濃度的P5091對(duì)食管鱗癌細(xì)胞KYSE450、KYSE510和KYSE30的增殖抑制效應(yīng)。4.細(xì)胞凋亡檢測:用AnnexinV-FITC和PI染色檢測不同濃度的P5091對(duì)食管鱗癌細(xì)胞KYSE450、KYSE510和KYSE30凋亡的影響。5.Caspasae-3的激活情況:用FITC-DEVD-FMK染色法檢測Caspase-3激活情況;Western Blot檢測P5091作用后食管鱗癌細(xì)胞KYSE450、KYSE510和KYSE30的c-PARP和c-caspase-3的表達(dá)情況。6.P5091對(duì)抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白的影響:Western Blot檢測P5091作用后食管鱗癌細(xì)胞KYSE450、KYSE510和KYSE30中抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白的變化,本實(shí)驗(yàn)中Noxa發(fā)生明顯變化。7.P5091對(duì)Noxa m RNA水平的影響:用Q-PCR的實(shí)驗(yàn)方法測定P5091處理食管鱗癌細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)促凋亡蛋白Noxa的m RNA水平變化。8.Noxa在P5091誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用:對(duì)Noxa基因沉默后通過流式細(xì)胞術(shù)來檢測不同濃度P5091引起的食管鱗癌細(xì)胞凋亡率的變化。9.轉(zhuǎn)錄因子4(Activating transcription factor 4,ATF4)上調(diào)Noxa:同時(shí)對(duì)Noxa和調(diào)節(jié)Noxa基因表達(dá)的上游調(diào)控分子ATF4進(jìn)行基因沉默,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度P5091引起的細(xì)胞凋亡率的變化。用Western blot的方法檢測對(duì)Noxa、ATF4基因沉默后凋亡標(biāo)志性蛋白c-PARP蛋白水平的變化。結(jié)果1.P5091抑制食管鱗癌細(xì)胞KYSE450、KYSE510和KYSE30的增殖ATPlite實(shí)驗(yàn)、平板克隆以及形態(tài)學(xué)觀察的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,P5091可以明顯抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖,并且呈濃度依賴性。2.P5091誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞KYSE450、KYSE510和KYSE30發(fā)生凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明不同濃度P5091引起食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡,總凋亡率隨藥物濃度增加而升高。同時(shí)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:細(xì)胞凋亡標(biāo)志性蛋白c-PARP和c-caspas3的表達(dá)增加,并且隨著藥物濃度增加而增高。3.P5091通過促進(jìn)促凋亡蛋白Noxa的表達(dá)來誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞的凋亡Western Blot結(jié)果顯示,P5091處理后Noxa蛋白水平明顯增高。Q-PCR結(jié)果顯示:P5091處理后在不同的時(shí)間點(diǎn)食管鱗癌細(xì)胞中Noxa的m RNA水平均有明顯升高。對(duì)食管鱗癌細(xì)胞進(jìn)行Noxa基因沉默后,不同濃度P5091引起食管鱗癌細(xì)胞的總凋亡率與Noxa基因敲除前相比明顯降低,且c-PARP蛋白水平也明顯降低,提示Noxa可能是P5091作用的關(guān)鍵分子。4.P5091誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)Western blot結(jié)果顯示P5091處理后ERS的標(biāo)志性蛋白p-EIF2α、ATF4、CHOP蛋白水平明顯增高,提示P5091誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生ERS。5.P5091通過上調(diào)ATF4,進(jìn)而引起Noxa積聚,最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡Western blot結(jié)果顯示P5091處理后ATF4和Noxa蛋白水平明顯升高,且流式結(jié)果提示P5091誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí),Q-PCR結(jié)果提示P5091也上調(diào)了Noxa的m RNA水平。為了進(jìn)一步探究Noxa是否是受ATF4調(diào)控,我們進(jìn)行Noxa和ATF4的基因沉默實(shí)驗(yàn)。結(jié)果提示:RNA干擾沉默ATF4后,P5091引起的細(xì)胞凋亡率明顯降低,c-PARP和Noxa蛋白水平明顯降低,提示ATF4很可能是P5091引起食管鱗癌細(xì)胞凋亡中Noxa積聚的主要調(diào)節(jié)因子。結(jié)論1.P5091顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖。2.P5091通過ERS上調(diào)ATF4的表達(dá),促進(jìn)Noxa的表達(dá),進(jìn)而引起食管鱗癌細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果.實(shí)驗(yàn)結(jié)果.1USP7 在食管鱗癌細(xì)胞系及組織中的表達(dá)情況檢測首先通過免疫印跡和免疫組化的實(shí)驗(yàn)方法檢測食管鱗癌細(xì)胞和組織中U白表達(dá)水平，初步了解 USP7 在食管鱗癌中的表達(dá)情況，也為下一步實(shí)驗(yàn)所胞系的篩選提供依據(jù)。綜合免疫印跡實(shí)驗(yàn)和免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步表明食管鱗癌細(xì)胞系和癌組織中 USP7 呈普遍表達(dá)的情況（圖 1）。此外，免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以看出，7 種食管鱗癌細(xì)胞系中 USP7 的表達(dá)水平并不一致可能與食管癌細(xì)胞的分化以程度、耐藥等因素有關(guān)。因此，，本實(shí)驗(yàn)中，選SP7 不同表達(dá)水平的細(xì)胞系 KYSE30、KYSE510 和 KYSE450 來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2 P5091 抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖3.2.1ATPlite 實(shí)驗(yàn)：用不同濃度梯度 P5091 分別處理三種食管鱗癌細(xì)胞 72h，通過 ATPlite 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力，判斷 P5091 對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果顯示，在相同的處理時(shí)間條件下，隨著 P5091 濃度的增高，細(xì)胞活力降低，即 P5091 對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的增殖抑制作用隨之也增加(與 DMSO 對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)，且呈劑量的依賴性。（圖 2）
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.1

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