【摘要】：背景:慢性粒細胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia,CML)是來源于多能造血干細胞的一種惡性增殖性疾病,具有高度增生和惡性侵襲的生物學特性。約占成年人白血病的20%。大部分CML患者都會出現(xiàn)Ph染色體的特異細胞遺傳學改變,即9號染色體長臂上ABL原癌基因易位至22號染色體長臂的斷裂點簇集區(qū)(BCR)形成BCR-ABL融合基因。該蛋白具有持續(xù)激活酪氨酸激酶活性,BCR-ABL酪氨酸激酶可激活下游信號通路促進細胞持續(xù)增殖、增強細胞遷移、影響細胞正常凋亡、阻斷細胞分化,引起CML。miR-4521異常表達與多種癌癥密切相關。FAM129A高表達與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展相關,FAM129A下調能夠抑制甲狀腺癌細胞增殖,遷移,侵襲及凋亡。但二者在CML進展及K562細胞惡性行為的研究尚無報道。目的:1.研究CML患者骨髓樣本中miR-4521,FAM129A表達及二者相關性;2.探討miR-4521與FAM129A間靶向負調控關系;3.研究miR-4521上調對K562生物學行為影響及分子機制;4.研究FAM129A下調對K562生物學行為影響及分子機制;方法:1.qRT-PCR法檢測miR-4521,FAM129A在33例人初發(fā)CML樣本,6例正常人樣本,及7例非惡性白血病樣本中表達情況,比較CML病人在初發(fā)及完全緩解(CR)情況下,miR-4521,FAM129A水平變化及相互間關系。2.通過miRNA預測軟件(TargetScan,miRDB)分析miR-4521與FAM129A間靶向關系;psi-CHECKTM2.0-WT-FAM129A-3'UTR/psi-CHECKTM2.0-MUT-FAM129A-3'UTR表達載體構建;將重組雙熒光素酶報告基因表達載體分別與miR-4521 mimic/NC mimic共轉染至293T細胞中,檢測雙熒光素酶的活性值,驗證靶向關系;3.利用LipofetaminTM 2000轉染試劑,將miR-4521 mimic瞬時轉染至K562中,qRT-PCR法檢測miR-4521上調效率及FAM129A表達;WB法檢測miR-4521上調對FAM129A表達影響;臺盼藍計數(shù)法檢測miR-4521上調對K562增殖影響;Transwell小室法檢測miR-4521上調對K562遷移,侵襲能力影響;qRT-PCR法檢測miR-4521上調后,MMP-2,MMP-9,TIMP-1表達;4.利用LipofetaminTM 2000轉染試劑,將si-FAM129A瞬時轉染至K562中,用WB法檢測FAM129A下調效率;臺盼藍計數(shù)法檢測FAM129A下調對K562增殖影響;Transwell小室法檢測FAM129A下調對K562遷移,侵襲能力影響,qRT-PCR法檢測FAM129A下調后,MMP-2,MMP-9,TIMP-1表達;結果:1.與正常樣本組相比,miR-4521呈現(xiàn)低表達,FAM129A呈現(xiàn)高表達,miR-4521,FAM129A在非惡性樣本中表達無差異;在同一患者樣本中,與初發(fā)CML樣本相比,二者表達水平在CR階段都出現(xiàn)“回復”現(xiàn)象;初發(fā)CML樣本中,miR-4521與FAM129A間表達水平負相關(P=0.0152,R2=0.2218);2.雙熒光素酶報告基因實驗表明,在MUT組中,NCmimic組與miR-4521mimic組的檢測活性無明顯差異,但WT組中,二者檢測活性差異明顯,與NC mimic相比,miR-4521mimic組的檢測活性降低44%,P=0.0022;3.瞬時轉染miR-4521 mimic后,K562增殖,遷移和侵襲能力均受到抑制,FAM129A基因和蛋白表達分別降低57.1%及蛋白水平降低41%,MMP-2,MMP-9基因表達均降低,TIMP-1表達升高;4.瞬時轉染si-FAM129A后,K562增殖,遷移和侵襲能力均受到抑制,MMP-2,MMP-9基因表達降低,TIMP-1表達升高。結論:1.miR-4521低表達,FAM129A高表達與CML發(fā)病正相關,CML病人治療CR后,二者表達水平逆轉回復;CML患者骨髓樣本中,miR-4521和FAM129A水平顯著負相關;2.miR-4521通過結合FAM129A 3'UTR區(qū)靶向負調控FAM129A表達;3.miR-4521上調能夠明顯抑制K562增殖,遷移,侵襲能力,降低MMP-2,MMP-9及升高TIMP-1表達;4.FAM129A下調能夠明顯抑制K562增殖,遷移,侵襲能力,降低MMP-2,MMP-9及升高TIMP-1表達;總之,miR-4521通過靶向負調控FAM129A表達,影響MMP-2,MMP-9,TIMP-1表達,進而影響K562細胞增殖,遷移,侵襲,以此影響CML發(fā)生,發(fā)展。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R733.72

【參考文獻】

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本文編號：2571179