【摘要】：慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是基于多能干細胞水平上的惡性疾病,特點是具有獲得性的異常的染色體,是一種造血干細胞惡性疾病,以骨髓及外周血中粒細胞的無限增殖為主要特征。特異性的細胞遺傳學變化在大約95%的慢性粒細胞白血病患者中都有發(fā)生,具體表現為9號和22號染色體發(fā)生易位,導致形成費城染色體(Ph染色體),并且產生BCR/ABL融合基因,其對應的融合蛋白具有可以異常升高酪氨酸蛋白激酶活性的特點,此融合蛋白可以催化并且磷酸化多種底物蛋白酪氨酸殘基,繼而激活多條信號傳導途徑,促進細胞增殖,減少細胞凋亡。目前,在慢性粒細胞白血病的治療中,酪氨酸激酶抑制劑被廣泛應用并且取得了很好的療效。但是,臨床上對該藥物的耐藥越來越明顯,研究并探索其他的治療方法已經成為白血病治療過程中急需解決的問題。唾液酸轉移酶在腫瘤細胞中的調節(jié)作用最近被廣泛的關注。而且,有許多世界各地的學者已經致力于研究多糖的變化與惡性腫瘤化療耐藥之間的關系,細胞膜上糖蛋白糖鏈的變化己經被確定了與白血病的耐藥相關。然而,唾液酸轉移酶在腫瘤的多藥耐藥中的作用尚未被完全了解。MicroRNA是一個大小約為22-25個堿基的微小分子,由于其具有著復雜的信號網絡以及對細胞的生物學行為具有多方面的影響,因此microRNA已經成為當前世界醫(yī)學研究領域中的新前沿熱點。MicroRNA與腫瘤疾病包括白血病之間的密切聯系已經為人們所了解。然而,microRNA以某種唾液酸轉移酶為靶點對慢性粒細胞白血病多藥耐藥性的調節(jié)作用尚未被知曉。本實驗對ST3GAL家族和ST6GALNAC家族在慢性粒細胞白血病多藥耐藥中的作用進行研究,同時研究microRNA在慢性粒細胞白血病多藥耐藥中所具有的調節(jié)作用。目的：通過研究ST3GAL和ST6GALNAC家族在三對人慢性粒細胞白血病細胞株及慢性粒細胞白血病患者外周血單個核細胞中的差異表達,明確ST3GAL和ST6GALNAC家族與人慢性粒細胞白血病多藥耐藥的相關性,并且研究miR-4701-5p以ST3GAL1作為靶點和miR-4299以ST6GALNAC4為靶點對人慢性粒細胞白血病多藥耐藥的影響,從而為預測和診斷慢性粒細胞白血病多藥耐藥性,尋求逆轉藥物提供新策略和靶點。方法：(1)采用real-time PCR技術和western-blot技術檢測三對人慢性粒細胞白血病細胞株及慢性粒細胞白血病患者外周血單個核細胞中的ST3GAL和ST6GALNAC家族的表達情況,篩選出具有差異表達ST基因。(2)特異性下調、上調差異表達的ST3GAL1基因和ST6GALNAC4基因,檢測干擾、過表達前后KCL22/ADR、KCL22細胞在體內、體外對化療藥物敏感性的變化。(3)采用real-time PCR檢測三對化學敏感和化學耐藥的人慢性粒細胞白血病細胞株和臨床慢性粒細胞白血病患者外周血單個核細胞中miR-4701-5p和miR-4299的表達變化。miR-4701-5p的模擬物(100nM)轉染到KCL22細胞中,將miR-4701-5p的拮抗劑轉染到KCL22/ADR細胞中,然后檢測ST3GAL1表達的變化。將miR-4299的模擬物(100nM)轉染到KCL22/ADR細胞中,將miR-4299的拮抗劑轉染到KCL22細胞中,然后對ST6GALNAC4表達的變化進行檢測。將ST3GAL1和ST6GALNAC4的3’-UTR的靶基因序列(wt 3’-UTR)和ST3GAL1和ST6GALNAC4的突變基因序列(mt 3’-UTR)克隆到熒光素酶報告基因載體,然后將wt.3'-UTR或mt 3’-UTR載體和miR-4701-5p模擬物轉染到KCL22細胞中以及miR-4299模擬物轉染到KCL22/ADR細胞中,進行熒光素酶活性檢測。(4)將miR-4701-5p的模擬物轉染到KCL22細胞中,而miR-4701-5p的拮抗劑轉染到KCL22/ADR細胞中,將miR-4299的模擬物轉染到KCL22/ADR細胞中,而miR-4299的拮抗劑轉染到KCL22細胞中,檢測化學藥物阿霉素、紫杉醇和長春新堿的IC50值,用以研究miR-4701-5p和miR-4299是否可以在體外調節(jié)CML細胞的藥物敏感性。將轉染了,miR-4701-5p的激活劑、,niR-4701-5p的拮抗劑、miR-4299的激活劑、miR-4299的拮抗劑和陰性對照的KCL22細胞和KCL22/ADR細胞接種到裸鼠體內,測量小鼠腫瘤體積；qRT-PCR和western blotting方法檢測腫瘤組織中ST3GAL1、ST6GALNAC4、miR-4701-5p和miR-4299的表達情況。第一部分結果：(1) ST3GAL2和ST3GAL3在KCL22、K562和KU812細胞中的表達與其阿霉素耐藥細胞株的表達在統計學上無明顯差異；ST3GAL1和ST3GAL5在三種藥物敏感的親本細胞株中基因及蛋白的表達明顯增高(*P0.05)；ST3GAL4在三種耐藥細胞系中呈現高表達(*P0.05)；而ST3GAL6在三對慢性粒細胞白血病細胞株中無表達。(2) ST3GAL4在CML/MDR患者外周血單個核細胞中呈高表達(*P0.05)；ST3GAL1和ST3GAL5在CML組中呈高表達(*P0.05)；ST3GAL2和ST3GAL3的表達在兩組中無明顯差異；ST3GAL6在兩組中表達量較低。(3)干擾ST3GAL1后的KCL22細胞株在：mRNA和蛋白水平上的表達均顯著降低,作用于KCL22-ST3GAL1 shRNAl細胞的抗腫瘤藥物的IC50值明顯高于對照組。未經阿霉素治療的小鼠在第21天到第28天期間,可以觀察到注射KCL22-ST3GAL1 shRNAl的小鼠平均瘤體積(891士92 mm3)顯著高于shRNA對照組(585士62 mm3,*P0.05)。在經阿霉素治療的小鼠中亦存在相同的現象。(4)特異性上調ST3GAL1后,作用于KCL22/ADR/ST3GAL1細胞的抗腫瘤藥物的IC50值明顯低于KCL22/ADR/mock細胞的IC50值。小鼠在注射KCL22/ADR/ST3GAL1后的平均瘤體積明顯低于注射KCL22/ADR/mock的小鼠。給小鼠注射同樣的KCL22/ADR/ST3GAL1,經過阿霉素治療的小鼠平均瘤體積明顯小于未經過阿霉素治療的小鼠。(5) MiR-4701-5p的表達量在KCL22、K562和KU812細胞和慢性粒細胞白血病患者外周血單個核細胞中顯著下降,而ST3GAL1在化學敏感細胞株及藥物敏感患者的細胞中表達是升高的。轉染了模擬物的KCL22細胞中ST3GAL1的mRNA及蛋白的表達量明顯下降,在轉染了miR-4701-5p拮抗劑的KCL22/ADR細胞中,ST3GAL1的mRNA及蛋白的表達量明顯上升。轉染了wt3’-UTR載體的KCL22細胞中miR-4701-5p表達的熒光素酶活性明顯下降,但是此結果可以被mt ST3GAL1逆轉。(6) MiR-4701-5p的高表達可顯著抑制KCL22細胞對化學藥物的敏感性,阿霉素、紫杉醇和長春新堿的IC50值升高。同時,在KCL22/ADR細胞中miR-4701-5p被拮抗劑所抑制后,可觀察到這三種化療藥物的IC50值下降。轉染了miR-4701-5p的小鼠的腫瘤體積在經過阿霉素化療后有明顯的改變,并且通過改變miR-4701-5p的表達可以調節(jié)ST3GAL1 mRNA和蛋白的表達。第二部分結果：(1) ST6GALNAC1、ST6GALNAC2和ST6GALNAC6在KCL22.K562和KU812細胞中的表達與其阿霉素耐藥細胞株的表達在統計學上無明顯差異。ST6GALNAC4在三種耐藥細胞系中呈現高表達(*P0.05)；而ST6GALNAC3和ST6GALNAC5在三對慢性粒細胞白血病細胞株中無表達。(2) ST6GALNAC4在CML/MDR患者外周血單個核細胞中呈高表達(*P0.05)。ST6GALNAC1、ST6GALNAC2和ST6GALNAC6的表達在兩組中無明顯差異。ST6GALNAC3和ST6GALNAC5在兩組中表達量較少。(3)干擾ST6GALNAC4后的KCL22/ADR細胞株在mRNA和蛋白水平上的表達均顯著降低,作用于KCL22/ADR-ST6GALNAC4 shRNA1細胞的抗腫瘤藥物的IC50值明顯低于對照組。在經阿霉素治療的小鼠和未經阿霉素治療的小鼠中,注射KCL22/ADR-ST6GALNAC4 shRNA1的小鼠平均瘤體積均顯著低于shRNA對照組(*P0.05)。(4)過表達ST6GALNAC4,作用于KCL22/ST6GALNAC4細胞的抗腫瘤藥物的IC50值明顯高于KCL22/mock細胞的IC50值。在經過阿霉素治療的小鼠和未經阿霉素治療的小鼠中,注射KCL22/ST6GALNAC4后的平均瘤體積均明顯高于KCL22/mock組。(5)在KCL22、K562和KU812細胞以及慢性粒細胞白血病患者外周血單個核細胞中miR-4299的表達量明顯上升,而ST6GALNAC4在化學敏感細胞株及藥物敏感患者的細胞中表達是下降的。在KCL22/ADR細胞中轉染了miR-4299模擬物后,ST6GALNAC4的mRNA及蛋白的表達量明顯的下降；在轉染了miR-4299拮抗劑的KCL22細胞中,則表現出相反的結果。而且,轉染了wt 3'-UTR載體的KCL22/ADR細胞中miR-4299表達的熒光素酶活性明顯下降,但是mtST6GALNAC4可以逆轉此結果。(6)MiR-4299的高表達可上調KCL22/ADR細胞對化學藥物的敏感性,阿霉素、紫杉醇和長春新堿的IC50值下降；同時,在KCL22細胞中miR-4299被拮抗劑所抑制后,可觀察到這三種化療藥物的IC50值上升。轉染了miR-4299的小鼠的腫瘤體積在經過阿霉素化療后有明顯的改變,并且改變miR-44299的表達可以調節(jié)ST6GALNAC4 mRNA和蛋白的表達。結論：(1) ST3GAL家族和ST6GALNAC家族在三對人慢性粒細胞白血病親本細胞株及其三對化學耐藥細胞株中存在差異表達。(2) ST3GAL家族和ST6GALNAC家族在耐藥與非耐藥的慢性粒細胞白血病患者外周血單個核細胞中存在差異表達。(3)改變ST3GAL1和ST6GALNAC4的表達,可以調控KCL22和KCL22/ADR細胞體內、外的藥物敏感性。ST3GAL1和ST6GALNAC4可以作為臨床慢性粒細胞白血病多藥耐藥的診斷和預后的標記物,可作為治療白血病耐藥性潛在的靶點。(4) MiR-4701-5p以ST3GAL1為靶點和miR-4299以ST6GALNAC4為靶點,可作為慢性粒細胞白血病多藥耐藥性所特有的miRNA來調節(jié)慢性粒細胞白血病細胞的多藥耐藥性。
【圖文】：

通過測量所形成的腫瘤體積來驗證阿霉素的治療效果。圖２Ｄ所示，在逡逑阿霉素治療組中的小鼠所形成的腫瘤體積隨著時間的延長而增長，，但其腫瘤體積逡逑X棾さ乃俾室饗緣陀諼淳⒚顧刂瘟頻男∈�。蕦上，未经阿妙欂治令l男″義鮮笤詰冢玻碧斕降冢玻柑炱詡洌桑墜鄄斕階⑸洌耍茫蹋玻玻粒模遙澹櫻裕叮牽粒蹋危粒茫村澹螅瑁遙危粒戾義系男∈篤驕鎏寤賈陀冢螅瑁遙危煉哉兆椋ǎ校跡埃埃擔�。哉a⒚顧刂瘟頻男∈籩兇㈠義仙洌耍茫蹋玻玻粒模遙澹櫻裕叮牽粒蹋危粒茫村澹螅瑁遙危粒斕男∈篤驕鎏寤嗍竅災陀冢螅杳瘢危鈴義隙哉兆椋ㄟ擔跡埃埃擔�。辶x

本文編號：2570389