【摘要】：1、背景：根據(jù)世界衛(wèi)生組織相關(guān)報(bào)道,腫瘤已經(jīng)超越心血管疾病成為世界上首要致死疾病。已有大量研究致力于闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制,為腫瘤診斷及治療提供依據(jù)。近年來(lái),腫瘤微環(huán)境這個(gè)重要概念的提出促進(jìn)了靶向腫瘤基質(zhì)的新型治療方法的出現(xiàn)。尤其是成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等能夠促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的間質(zhì)成分,越來(lái)越成為腫瘤治療的重要目標(biāo)。腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞及細(xì)胞外間質(zhì)相互作用所形成的特殊環(huán)境,細(xì)胞外間質(zhì)成分包括成纖維細(xì)胞、炎癥細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞,血管周細(xì)胞,間充質(zhì)干細(xì)胞,細(xì)胞外基質(zhì)及多種細(xì)胞因子,其中,腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞是微環(huán)境中的主要間質(zhì)成分。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞最常見(jiàn)的標(biāo)志物是a-SMA,但是僅僅通過(guò)a-SMA檢測(cè)不足以鑒定CAFs[10,19,20],其他廣泛應(yīng)用的CAFs標(biāo)志物還包括成纖維細(xì)胞特異性蛋白(FSP),成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAP),血小板衍化生長(zhǎng)因子受體a/β(PDGFRa/β)[14,。FSP調(diào)控細(xì)胞周期、參與維持完整的細(xì)胞骨架,其異常表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移。FAP特異性表達(dá)于血管周細(xì)胞以及創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中及腫瘤間質(zhì)中的活化成纖維細(xì)胞。FAP在90%的實(shí)體腫瘤中可被激活。在人類(lèi)90%腫瘤中可以檢測(cè)到PDGFRa/β[13]。不同類(lèi)型腫瘤中的CAFs具有高度異質(zhì)性,其來(lái)源尚有爭(zhēng)議,可能來(lái)源于宿主間質(zhì)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及骨髓間質(zhì)干細(xì)胞等。許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的均已證實(shí)CAFs能分泌生長(zhǎng)因子促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。由于CAFs是腫瘤間質(zhì)中的主要細(xì)胞類(lèi)型又具有促瘤作用,靶向CAFs的藥物治療手段越來(lái)越受到人們的重視。因此,我們此項(xiàng)研究致力于在體外環(huán)境下模擬正常成纖維細(xì)胞的活化過(guò)程,并探討在此過(guò)程中腫瘤細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的性狀各發(fā)生何種變化。2、研究方法2.1光鏡下觀察小鼠胚胎來(lái)源的成纖維細(xì)胞在共培養(yǎng)前和共培養(yǎng)30d后形態(tài)變化,并通過(guò)細(xì)胞免疫熒光鑒定該成纖維細(xì)胞的來(lái)源。2.2將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH/3T3與小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系CT26進(jìn)行體外間接共培養(yǎng),將共培養(yǎng)3d、6d、9d、12d、15d的成纖維細(xì)胞與未經(jīng)處理的NFs細(xì)胞,行a-SMA蛋白熒光染色,以lOng/ml重組人TGF-β作用72h的成纖維細(xì)胞作為活化成纖維細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn),比較共培養(yǎng)不同時(shí)間的成纖維細(xì)胞的活化程度的變化。2.3采用a-SMA、FAP、FSP1、PDGFRa/(3作為活化成纖維細(xì)胞特異性標(biāo)志物,比較共培養(yǎng)后正常成纖維細(xì)胞上述蛋白表達(dá)水平變化。取共培養(yǎng)Od、3d、6d、9d、 12d.15d、30d的成纖維細(xì)胞做Western blot檢測(cè),以單獨(dú)培養(yǎng)的經(jīng)過(guò)相同傳代次數(shù)的NFs作為陰性對(duì)照組,以lOng/ml重組人TGF-β作用NFs 72h作為陽(yáng)性對(duì)照。2.4收集共培養(yǎng)Od.6d、15d.30d的大腸癌細(xì)胞CT26消化離心,2%血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組用2%血清培養(yǎng)液重懸未經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)但經(jīng)過(guò)相同傳代次數(shù)的普通CT26細(xì)胞,配制細(xì)胞懸液濃度為5×105/ml,向transwell小室的上室中加入200μ1單細(xì)胞懸液,向transwell小室的下室中加10%血清濃度的培養(yǎng)液600u1。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱12h后,取出小室,進(jìn)行HE染色,顯微鏡下觀察穿過(guò)的腫瘤細(xì)胞。2.5將共培養(yǎng)15d、30d及普通培養(yǎng)但經(jīng)過(guò)相同傳代次數(shù)的CT26細(xì)胞分別進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn),分別在Oh、6h、12h、24h鏡下觀察,并拍照,將照片上傳wimasis.com網(wǎng)站進(jìn)行數(shù)據(jù)分析每個(gè)時(shí)間點(diǎn)腫瘤細(xì)胞覆蓋面積。2.6取普通培養(yǎng)的CT26細(xì)胞按30萬(wàn)/孔種六孔板作為對(duì)照組,隔天加藥,分別是順鉑(0.10.20.40.80.160umol/1)；奧沙利鉑(0.20.40.80.160.320umol/1);氟尿吡啶(0.10.20.40.80.160umol/l)；伊立替康(0、20.40.80.160. 320umol/l)。藥物作用24h后,胰酶消化,離心、重懸、臺(tái)盼藍(lán)染色、計(jì)數(shù)、計(jì)算不同藥物不同濃度作用下CT26細(xì)胞的存活率,每種藥物至少重復(fù)三次。選取經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)30d的CT26細(xì)胞重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。2.7收集與大腸癌細(xì)胞CT26間接共培養(yǎng)30d的成纖維細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組,培養(yǎng)相同時(shí)間并經(jīng)歷相同傳代次數(shù)的正常成纖維細(xì)胞作為對(duì)照組,分別從細(xì)胞中提取總RNA,利用microRNA芯片技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析,篩選出表達(dá)差異譜。3、結(jié)果：3.1經(jīng)共培養(yǎng)后,成纖維細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變。通過(guò)細(xì)胞免疫熒光鑒定本研究培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞,結(jié)果提示Vimentin(+).α-SMA部分(+)、Pan cytokeratin(-). Desmin(-),提示該細(xì)胞為間質(zhì)成分來(lái)源且成分較為均一。3.2隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著升高,且表達(dá)增強(qiáng),同時(shí)細(xì)胞骨架變大變寬,表明正常成纖維細(xì)胞向肌源性成纖維細(xì)胞即活化成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到15d左右,成纖維細(xì)胞達(dá)到活化狀態(tài)。3.3隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),成纖維細(xì)胞中α-SMA、FAP.FSP.PDGFRβ的表達(dá)水平逐漸升高,共培養(yǎng)2w左右,成纖維細(xì)胞上述蛋白的表達(dá)水平已達(dá)到與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)水平,結(jié)合之前免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果,我們可以判斷,共培養(yǎng)15d左右,成纖維細(xì)胞達(dá)到活化狀態(tài)。3.4未經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)的CT26細(xì)胞12h后幾乎沒(méi)有細(xì)胞穿過(guò)8.0um聚碳酸酯膜,共培養(yǎng)6d、15d、30d的腫瘤細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜的數(shù)目逐漸增多,結(jié)果表明,隨著共培養(yǎng)時(shí)間的增加,腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。3.5在Oh,三組腫瘤細(xì)胞(共培養(yǎng)30d、共培養(yǎng)15d、共培養(yǎng)Od)覆蓋面積分別為62.9%、62.6%、62.2%,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在6h,三組腫瘤細(xì)胞(共培養(yǎng)30d、共培養(yǎng)15d、共培養(yǎng)0d)覆蓋面積分別為71.6%、67.3%、65.5%；在12h,三組腫瘤細(xì)胞(共培養(yǎng)30d、共培養(yǎng)15d、共培養(yǎng)0d)覆蓋面積分別為88%、81.3%、68%；在24h,三組細(xì)胞(共培養(yǎng)30d、共培養(yǎng)15d、共培養(yǎng)0d)覆蓋面積分別為99.3%、91%、76.6%。由此可見(jiàn),在6h、12h以及24h,經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞覆蓋面積均大于普通培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞,且在每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)共培養(yǎng)30d的腫瘤細(xì)胞覆蓋面積最大,24h后細(xì)胞覆蓋面積達(dá)99.3%。3.6普通培養(yǎng)及共培養(yǎng)30d的腫瘤細(xì)胞在順鉑、奧沙利鉑、氟尿嘧啶、伊立替康四種常用化療藥物的作用下,存活率都降低,但兩組細(xì)胞的存活率無(wú)明顯差異。3.7使用Aligent microRNA專(zhuān)用軟件分析掃描圖像所得數(shù)據(jù),分別計(jì)算出兩種樣本中microRNA的標(biāo)準(zhǔn)值及比值。判斷標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組表達(dá)量比值2為表達(dá)上調(diào),0.5則為表達(dá)下調(diào),篩選出一組表達(dá)量上調(diào)及一組表達(dá)量下調(diào)的microRNA。4、結(jié)論4.1 CT26細(xì)胞株可以活化正常成纖維細(xì)胞,并且不依賴(lài)細(xì)胞之間的相互接觸；4.2成纖維細(xì)胞的活化狀態(tài)對(duì)CT26細(xì)胞遷移和侵襲有重要影響,但經(jīng)共培養(yǎng)的CT26細(xì)胞對(duì)常見(jiàn)大腸癌化療藥物的耐藥性變化不大；4.3通過(guò)對(duì)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞microRNA的研究,可探討CAFs中micro RNA分子的調(diào)控對(duì)抗腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。
【圖文】：

殖、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)，腫瘤細(xì)胞必須與它周?chē)沫h(huán)境因素起協(xié)同作用，這一假說(shuō)為＂腫逡逑瘤微環(huán)境＂的提出奠定了基礎(chǔ)Ｅ２５３。腫瘤微環(huán)境由多種細(xì)胞成分及因子組成的特殊逡逑環(huán)境，為腫瘤的增殖浸潤(rùn)等生物學(xué)行為提供了不可或缺物質(zhì)基礎(chǔ)（圖２），，因此腫逡逑瘤微環(huán)境局部缺氧及酸性狀態(tài)與腫瘤血管的異常增殖，遁透性增加，及糖酵解代逡逑謝增強(qiáng)有關(guān)ｕａ。關(guān)于ＣＡＦｓ促進(jìn)腳瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制可Ｗ大致歸納為；ＣＡＦｓ通逡逑過(guò)分泌趨化因子、生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白路從而促進(jìn)血管生成和基庇膜破壞，逡逑使腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)逡逑腫瘤基質(zhì)中活化的成纖維細(xì)胞被稱(chēng)作腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（ｃａｎｃｅｒ逡逑ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｆ化ｒｏｂｌａｓｔｓ，邋ＣＡＦｓ），又稱(chēng)肌纖維母細(xì)胞。在大多數(shù)實(shí)體腫瘤中，腫逡逑瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的數(shù)量占了腫瘤間質(zhì)細(xì)胞的絕大部分。雖然目前尚無(wú)可靠研究逡逑證實(shí)腫瘤成纖維細(xì)胞的來(lái)源，這一領(lǐng)域化飽受爭(zhēng)議，但是ＣＡＦｓ在巧瘤微環(huán)境中表逡逑達(dá)多種細(xì)胞因子、枯附因子、雖白w齲廡┥鏌蠐諭ü嘀滯揪洞俳裝┑膩義涎萇�，肿笼_納ぴ鮒臣敖笄ㄒ啤Ｖ琢魷喙爻上宋赴俳琢齜⑸⒄瑰義系幕頗殼吧脅磺宄�，訉�(xiě)詬徊降難芯俊Ｄ殼�，有研究钡a鰨祝茫粒疲蟛義匣式到餉父謀湎赴饣式峁勾傭俳琢魷赴窒妥

本文編號(hào)：2559580