【摘要】：原發(fā)性肝癌(簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌,Hepatocellular carcinoma,HCC)是常見(jiàn)惡性腫瘤,近年來(lái)在世界范圍內(nèi)發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì),給社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。手術(shù)切除是其主要治療手段,但是手術(shù)后腫瘤的高復(fù)發(fā)率嚴(yán)重影響了治療效果,研究預(yù)測(cè)腫瘤手術(shù)切除后復(fù)發(fā),是提高肝癌臨床療效,改善患者預(yù)后及生存質(zhì)量亟待解決的重大科學(xué)問(wèn)題。隨著二代測(cè)序技術(shù)和生物信息分析技術(shù)的進(jìn)展,發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的長(zhǎng)鏈非編碼RNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,是目前研究的最前沿領(lǐng)域,是新的腫瘤標(biāo)志物和藥物靶標(biāo)的重要來(lái)源。因?yàn)殚L(zhǎng)鏈非編碼RNA對(duì)腫瘤的調(diào)控處于基因的上游階段,受干擾較少,研究其對(duì)肝癌的預(yù)后影響及機(jī)制,能夠?yàn)楦伟┡R床診斷與治療提供了新的研究策略。第一部分:肝細(xì)胞肝癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA的篩選與功能學(xué)驗(yàn)證研究目的:篩選出在肝癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA并在組織學(xué)和細(xì)胞系中驗(yàn)證其差異表達(dá)能力,選取進(jìn)一步研究的目標(biāo)RNA。研究方法:利用二代測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法篩選肝切除術(shù)后肝癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA,并進(jìn)一步在正常肝細(xì)胞系、肝癌細(xì)胞系中驗(yàn)證其表達(dá)能力。研究結(jié)果:利用構(gòu)建的肝癌基因芯片同時(shí)檢測(cè)肝癌組織和癌旁組織中長(zhǎng)鏈非編碼RNA和信使RNA的表達(dá)量,篩選出差異性表達(dá)的LncRNA632條和mRNA391條,其中7條 LncRNA (p2609/p33560/ p3816/p40127-v4/p22534/p8751/p42540-v4)在肝癌病人中與mRNA表現(xiàn)出一致表達(dá),15條LncRNA被檢測(cè)出呈現(xiàn)出明顯差異表達(dá)。通過(guò)細(xì)胞和組織學(xué)驗(yàn)證,結(jié)果顯示IncRNA-C2、LncRNA-P7和LncRNA-P12呈現(xiàn)出明顯差異性表達(dá),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,遂選定差異表達(dá)最明顯的LncRNA-P7,并命名為L(zhǎng)INC RP1130-1。核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:LINC RP1130-1絕大部分存在于細(xì)胞質(zhì)中,則表明LINC RP1130-1很可能通過(guò)與某個(gè)特定通路蛋白結(jié)合發(fā)揮其調(diào)控功能。在了解了 LINC RP1130-1的作用部位后,我們對(duì)其在HCC復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的作用做了進(jìn)一步的機(jī)制研究。第二部分:LINC RP1130-1通過(guò)STAT1-MAPK通道影響肝癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移研究目的:探索L INC RP1130-1在肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的可能作用機(jī)制。研究方法:通過(guò)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,過(guò)表達(dá)基因和沉默基因表達(dá)技術(shù)、蛋白免疫印跡技術(shù)、細(xì)胞活力測(cè)定、細(xì)胞增殖與凋亡能力等方法,分別在基因水平,蛋白水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn),尋找LINC RP1130-1的基因靶點(diǎn)和可能的蛋白位點(diǎn)。研究結(jié)果:研究表明LncRNA-P7 (LINC RP1130-1)可以抑制肝癌腫瘤細(xì)胞的增殖,促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程;研究還發(fā)現(xiàn)LINC RP1130-1可調(diào)控STAT1基因的轉(zhuǎn)錄,并進(jìn)而影響該基因所關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平;其表達(dá)量增加可顯著降低STAT1基因的轉(zhuǎn)錄水平,降低STAT1蛋白和ERK1/2蛋白的表達(dá)量。我們認(rèn)為L(zhǎng)ncRNA-P7 (LINC RP1130-1)可能是通過(guò)STAT-MAPK信號(hào)通路在肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到重要作用。第三部分:長(zhǎng)鏈非編碼RNA (LNCRNA-P7/LINCRP1130-1)與臨床信息的關(guān)系研究目的:研究LINC RP1130-1與肝癌病人臨床相關(guān)信息之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系,探討LINC RP1130-1在臨床診治中的意義和作用。研究方法:分別測(cè)量肝癌組織和癌旁組織中的LINC RP1130-1表達(dá)量,將其按照表達(dá)量高低分為兩組,采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析兩組病人之間其他臨床信息之間差異。研究結(jié)果:研究發(fā)現(xiàn)相比較對(duì)應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)量,LINC RP1130-1在肝癌組織中的表達(dá)量呈現(xiàn)明顯低表達(dá),在肝癌細(xì)胞系中的驗(yàn)證也證實(shí)LINC RP1130-1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)量低于正常肝細(xì)胞,而且LINC RP1130-1低表達(dá)組無(wú)瘤生存時(shí)間(disease free survival, DFS)較高表達(dá)組顯著延長(zhǎng),兩組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0. 047)。研究中還發(fā)現(xiàn)LINC RP1130-1的表達(dá)與臨床分期、肝硬化,門(mén)靜脈癌栓、微血管癌栓、腫瘤數(shù)量等因素密切相關(guān)。受試者曲線(xiàn)面積(Areaundercurve,AUC)為0.74,這表明LINC RP1130-1的表達(dá)在肝癌診斷中具有很好的特異性和敏感性,能夠很好的用于肝癌的早期診斷。結(jié)論:很多研究表明,長(zhǎng)鏈非編碼RNA在人體內(nèi)廣泛存在,參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。我們的研究發(fā)現(xiàn),相比較正常肝細(xì)胞,LncRNA-P7 (LINCRP1130-1)在肝癌細(xì)胞系表現(xiàn)為顯著的低表達(dá),同樣,相比較于癌旁組織,LncRNA-P7 (LINCRP1130-1)在肝癌組織中也表現(xiàn)為顯著的低表達(dá),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步將LncRNA-P7 (LINC RP1130-1)與臨床病人資料進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)LncRNA-P7 (LINCRP1130-1)的表達(dá)與臨床分期、肝硬化,門(mén)靜脈癌栓、微血管癌栓、腫瘤數(shù)量等因素密切相關(guān)。LncRNA-P7 (LINC RP1130-1)低表達(dá)組無(wú)瘤生存時(shí)間比高表達(dá)組顯著延長(zhǎng),兩組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.047)。受試者曲線(xiàn)面積(AUC)為 0.74,表明 LncRNA-P7 (LINCRP1130-1)的表達(dá)在肝癌診斷中具有很好的特異性和敏感性,能夠很好的用于肝癌的早期診斷�？偟膩�(lái)說(shuō),LncRNA-P7 (LINCRP1130-1)參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,可以作為一類(lèi)新型的具有生物學(xué)功能的臨床標(biāo)志物進(jìn)一步研究,具有非常廣闊的臨床應(yīng)用前景。
【圖文】：

解放軍醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文逡逑實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑一、目標(biāo)ＬｎｃＲＮＡ的篩選逡逑我們利用基因芯片和生物信息學(xué)分析比較得出：肝癌組織與癌旁組織中共有３９１逡逑條ＬｎｃＲＮＡｓ和６３２條ｍＲＮＡｓ有顯著差異表達(dá)（差異倍數(shù)＞２，ＦＤＲ值＜０．０５）。結(jié)逡逑果顯示：與患者癌旁組織相比較，肝癌組織中有許多ＬｎｃＲＮＡ與ｍＲＮＡ表達(dá)量發(fā)生逡逑了差異。預(yù)示著癌組織中的表觀遺傳學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)生了很大的改變，有助于后期相關(guān)逡逑研究者更好的探討ＬｎｃＲＮＡｓ與腫瘤疾病轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)間的關(guān)聯(lián)。逡逑

圖２：差異表達(dá)ＬｎｃＲＮＡｓ和ｍＲＮＡ聚類(lèi)圖。通過(guò)基因芯片篩選，可以發(fā)現(xiàn)肝癌與逡逑癌旁組織中有３９１條ＬｎｃＲＮＡｓ邋（左）和６３２條ｍＲＮＡｓ邋（右）有顯著差異表達(dá)。（ＦＣ＞２，逡逑ＦＤＲＣＯ．邋０５，綠色區(qū)域越明亮代表下調(diào)倍數(shù)越大，紅色區(qū)域越明亮代表上調(diào)倍數(shù)越大）逡逑隨后我們對(duì)上述ＬｎｃＲＮＡ與ｍＲＮＡ進(jìn)行了共表達(dá)分析，分析顯示有７條ＬｎｃＲＮＡ逡逑與相應(yīng)ｍＲＮＡ呈現(xiàn)顯著相關(guān)性（Ｒ２＞０．９９９），這７條ＬｎｃＲＮＡ在腫瘤中呈現(xiàn)顯著下逡逑調(diào)趨勢(shì)（圖３．綠色區(qū)域越明亮代表下調(diào)倍數(shù)越大，紅色區(qū)域越明亮代表上調(diào)倍數(shù)越逡逑大）。預(yù)示著這７條ＬｎｃＲＮＡ與其相應(yīng)共表達(dá)的ｍＲＮＡ調(diào)控可能已經(jīng)失調(diào)。在腫瘤發(fā)逡逑生發(fā)展過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，同樣也預(yù)示著這７條ＬｎｃＲＮＡ可能是通過(guò)影響逡逑這些ｍＲＮＡ的表達(dá)從而發(fā)揮其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的功能。同時(shí)，，這些ｍＲＮＡ也可能逡逑是這７條ＬｎｃＲＮＡ的靶基因。逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 Ai-Ru Hsieh;Cathy SJ Fann;Chau-Ting Yeh;Hung-Chun Lin;Shy-Yi Wan;Yi-Cheng Chen;Chia-Lin Hsu;Jennifer Tai;Shi-Ming Lin;Dar-In Tai;;Effects of sex and generation on hepatitis B viral load in families with hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2017年05期

2 呂細(xì)林;黃剛;肖曼;劉孟剛;陳sョ

本文編號(hào)：2559223