【摘要】：第一部分肝癌干細胞的檢測、分離純化、培養(yǎng)和鑒定目的：檢測不同肝癌細胞株的腫瘤干細胞標記物表達水平,選取高表達細胞株分離標記物陽性細胞進行培養(yǎng),并對培養(yǎng)的陽性細胞進行干細胞鑒定。方法：CD133作為常用的肝癌干細胞標記物,用CD133磁珠抗體孵育并結合表達其抗原的肝癌細胞,運用磁珠分選技術分離純化陽性細胞。分離純化后的肝癌干細胞用含有高生長因子的干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)以維持其干細胞特性,抑制分化。比較CD133抗原陰性和陽性的肝癌細胞,其表達胚胎干細胞標記物的水平,包括SOX2、OCT4和NANOG。結果：流式細胞技術檢測肝癌細胞株HepG2、Huh-7和PLC-PRF-5表達CD133的細胞比例分別為10.8%、0.176%和0.07%。選取HepG2細胞進行CD133陽性細胞磁珠分選,培養(yǎng)于含高生長因子的培養(yǎng)基。對分選出的CD133-和CD133+HepG2細胞,提取蛋白進行蛋白免疫印跡分析(Western Blot),顯示胚胎干細胞標記物在CD133+ HepG2細胞中高表達。結論：肝癌細胞HepG2有CD133抗原表達,此類細胞高表達胚胎干細胞標記物,指示CD133陽性的HepG2細胞具有腫瘤干細胞特性。第二部分全反式維甲酸分化肝癌干細胞目的：分離純化肝癌細胞HepG2中的腫瘤干細胞(CD133＋),檢測全反式維甲酸(ATRA)對肝癌干細胞的分化效果。方法：肝癌細胞HepG2在10%胎牛血清中培養(yǎng),用腫瘤干細胞標記物CD133的磁珠抗體分離純化出肝癌干細胞(HepG2/CD133+),培養(yǎng)于含高濃度生長因子(20 ng/mL EGF、10 ng/mL FGF2和B27)的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基,以維持干細胞特性。全反式維甲酸(ATRA)以不同濃度(10-9～10-5M)加入到干細胞培養(yǎng)基,在不同培養(yǎng)時間檢測腫瘤干細胞標記物CD133和胚胎干細胞標記物SOX2、OCT4、NANOG的表達。結果：肝癌干細胞(HepG2/CD133+)在ATRA處理12小時和24小時后,細胞流式分析顯示細胞表面的CD133抗原表達降低,蛋白免疫印跡分析(Western blot)也表明腫瘤干細胞標記物CD133蛋白表達減少。同時,肝癌干細胞(HepG2/CD133+)在含不同濃度ATRA的干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天后,胚胎干細胞標記物SOX2、OCT4、NANOG蛋白表達在ATRA濃度升高時蛋自水平顯著降低。結論：肝癌干細胞(HepG2/CD133+)在全反式維甲酸處理后,干細胞特性顯著降低。第三部分臨床肝癌組織中的維甲酸代謝目的：肝是人體合成維甲酸的器官,而全反式維甲酸是常見的抗癌藥,在白血病中通過分化癌變造血干細胞,最終使之凋亡。研究肝癌組織中維甲酸代謝,將有助于研究肝癌發(fā)生、發(fā)展,以及肝癌干細胞抗分化機制。方法：通過臨床數(shù)據(jù)庫Oncomine database,分析在肝癌病人組織中參與由視黃醇合成視黃醛,再由視黃醛脫氫合成維甲酸過程中脫氫酶的表達和活性,并和正常組織和其他類型腫瘤組織進行比較,研究肝癌組織中維甲酸的代謝特點。結合臨床肝癌病人的免疫組織化學(IHC)分析,檢測肝癌組織中與維甲酸合成有關的乙醇脫氫酶、視黃醇脫氫酶和視黃醛脫氫酶表達,反應維甲酸合成信號活性。結果：通過分析Oncomine database數(shù)據(jù)庫1911例16種不同癌癥病人的組織樣本,(其中膀胱癌32例、腦癌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥4例、乳腺癌328例、宮頸癌35例、結直腸癌330例、食道癌328例、胃癌7例、頭頸癌41例、腎癌254例、肝癌11例、肺癌107例、淋巴瘤19例、口癌166例、胰腺癌19例、前列腺癌59例、惡性毒瘤49例),發(fā)現(xiàn)維甲酸合成所需的合成酶系統(tǒng),包括乙醇脫氫酶(ADH1)、視黃醇脫氫酶(RDH10)和視黃醛脫氫酶(RALDH1)的mRNA在肝癌組織中的表達最高。在蛋白水平,分析了各3例肝癌組織樣本和正常肝組織樣本,檢測到乙醇脫氫酶(ADH1)、視黃醇脫氫酶(RDH10)和視黃醛脫氫酶(RALDH1)在肝癌組織中都有表達,尤其視黃醇脫氫酶(RDH10)的表達最高。結論：維甲酸合成所需的酶系統(tǒng)(ADH1、RDH10、RALDH1)、mRNA在肝癌組織的表達高于其他15種癌癥組織,免疫組織化學分析也檢測到這些酶在肝癌組織中的蛋白表達。第四部分全反式維甲酸增加肝癌干細胞對抗癌藥物的敏感性目的：在肝癌以及其他癌癥治療中,對抗腫瘤藥物治療的耐藥性和腫瘤術后復發(fā)是兩大難題。經(jīng)過長期的基礎和臨床研究發(fā)現(xiàn),腫瘤中含有對腫瘤的發(fā)生、生長和轉移起到關鍵作用的一個細胞群,該類細胞高表達胚胎干細胞標記物。尋找降低該類細胞的干細胞特性、增加對抗癌藥物敏感性的方法,將為腫瘤治療提供新的治療思路和途徑。方法：全反式維甲酸(ATRA)以不同濃度(10-7、10-6、10-5M)處理肝癌干細胞HepG2/CD133+后,用抗癌藥物多烯紫杉醇(Docetaxel, DOC)進行殺傷,并和DOC單獨處理組進行比較,檢測細胞增殖活性和細胞凋亡的變化和對裸鼠成瘤性的影響。結果：全反式維甲酸分別以10-7、10石、10-5M濃度處理HepG2/CD133+細胞5天,細胞的增殖活性沒有降低,在濃度最高組(10-5M)的增殖活性還略有升高(120%)。多烯紫杉醇分別以10-10、10-9、10-8M濃度處理HepG2/CD133+細胞5天,細胞增殖活性隨著多烯紫杉醇的濃度升高而分別降低至85%、70%、55%。結合全反式維甲酸和多烯紫杉醇,ATRA在10-7、10-6、10-5M濃度配合DOC(10-9M)對肝癌干細胞HepG2/CD133+進行殺傷,發(fā)現(xiàn)藥物配合組比多烯紫杉醇單獨處理組的細胞組織活性出現(xiàn)顯著降低(P0.01)。用染料PI和Annexin V對細胞凋亡情況進行檢測,發(fā)生晚期凋亡的細胞比例明顯升高。DMSO對照組細胞、ATRA和DOC單獨處理組細胞、以及ATRA聯(lián)合DOC處理后細胞,皮下注射到裸鼠進行成瘤性實驗,結果發(fā)現(xiàn)第55天對照組的腫瘤體積為400.00mm3, ATRA和DOC單獨處理的肝癌干細胞成瘤性并未沒有出現(xiàn)顯著變化,腫瘤體積分別為321.73 mm3和150.59 mm3,而ATRA聯(lián)合DOC處理后的肝癌干細胞成瘤性受到很大抑制,僅為22.93 mm3。結論：全反式維甲酸分化肝癌干細胞HepG2/CD133+后,對抗癌藥物多烯紫杉醇敏感性升高；ATRA和DOC藥物的配合使用增加了對肝癌干細胞HepG2/CD133+的殺傷效果,使肝癌細胞發(fā)生凋亡,裸鼠成瘤性降低。第五部分β-catenin信號介導全反式維甲酸分化肝癌干細胞目的：全反式維甲酸分化肝癌干細胞HepG2/CD133+,研究其分化的分子機制,將為分化和治療肝癌干細胞尋找出多種藥物靶點,為臨床應用提供切實有效途徑。方法：PI3K/AKT通路和β-catenin蛋白在細胞增殖、細胞活性、腫瘤發(fā)生和發(fā)展、胚胎干細胞分化發(fā)育中有重要作用,研究在全反式維甲酸分化肝癌干細胞HepG2/CD133+過程中,其蛋白信號的變化情況。通過對β-catenin蛋白表達進行干擾調(diào)節(jié),進一步證實PI3K/AKT通路和β-catenin蛋白全反式維甲酸誘導的肝癌干細胞分化的作用機制。結果：全反式維甲酸分別以10-7、10-6、10-5M濃度處理HepG2/CD133+細胞5天,PI3K蛋白表達和AKT磷酸化水平顯著降低；β-catenin蛋白水平降低,磷酸化水平升高,mRNA水平?jīng)]有發(fā)生明顯變化,說明β-catenin通過磷酸化途徑被降解。而PI3K/AKT信號負責與GSK3β蛋白結合,阻止GSK3β降解β-catenin,全反式維甲酸抑制PI3K/AKT信號后,GSK3β蛋白被釋放,使β-catenin蛋白受到降解。結論：全反式維甲酸通過抑制PI3K/AKT信號,釋放GSK3P蛋白,降解β-catenin,誘導分化肝癌干細胞HepG2/CD133+。
【圖文】：

逑中的生長情況逡逑Ｈ種肝癌細胞株在ＤＭＥＭ邋（含１０％ＦＢＳ）中呈貼壁性生長（圖１）逡逑郵０２邐Ｈｕｈ－７邐ＰＬＣ／ＰＲＦ－５逡逑畫畫S/逡逑圖１：蘭種肝癌細胞株在ＤＭＥＭ中的生長情況（１０倍）逡逑Ｉ＾ｉｇｕｒｅ邋１邋Ｔｈｒｅｅ邋ｈｅｐａｔｉｃ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｃｅｌｌ邋ｌｉ打ｅｓ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｉｎ邋ＤＭＥＭ邋ｍｅｄｕｉｎ邋（邋１０邋ｆｏｌｄ）逡逑２腫瘤干細胞標記物ＣＤ１３３在Ｈ種不同肝癌細胞株中的表達逡逑Ｈ個細胞株用含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培養(yǎng)基陪１４天Ｗ后，，用化２５％的族酶消逡逑化至單個細胞，在４°Ｃ用Ｆ打Ｃ標記的ＣＤ１３３抗體（ＦＩＣＴ／ＣＤ１３３）艇育１０分鐘逡逑后進行細胞流式分析。黑色線條是抗體的ＩｇＧ同型對照（Ｉｓｏｔｙｐｅ），結果顯示Ｈ逡逑株細胞的ＣＤ１３３抗原含量差異較大，有ＣＤ１３３抗原表達（藍色）的ＨｅｐＧ２細逡逑胞為１０．８％，Ｈｕｈ－７細胞為０．１６７％，ＰＬＣ－Ｐ民Ｆ－５為０．０７％，ＨｅｐＧ２細胞的表達率逡逑最高（圖２）。本課題挑選ＣＤＤ３＋細胞高達１０．８％的Ｈ巧Ｇ２細胞進行實驗，Ｗ保逡逑證實驗的可操作性。逡逑Ｈ邋巧邋Ｇ２邐Ｈｕｈ－７邐ＰＬＣ－ＰＲＦ－５逡逑—邐７邋三邋ｃｍ呵邐—ＣＤ１３３邐＾邋ＣＤ＂３逡逑ｆ邋１逡逑Ｉ邋Ｉ邋＼ｌ０．８％邐Ｉ邋ｋｌ６７％邐０．０７％逡逑０邋一邋邋＇羞’邋＇ｌｌ＂，邋邋Ｉ邐■ｎｊ￣？邐－逡逑０邋１0４邐１０？邐１０？邐１0７邐０邋１０＊邐１０＊邐１０＊邐１0７邐０邋ｌＯ＊邋１０？邐１０＊邐１０

－腫瘤細胞在含有１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培養(yǎng)基中呈貼壁細胞性逡逑生長（圖４）逡逑ＣＤ１３３邋ｎｏｎ－ｈＣＳＣｓ逡逑葬逡逑圖４ＣＤ１３３－腫瘤細胞在ＤＭＥＭ邋（含１０％ＦＢＳ）培養(yǎng)基中生長的情況逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４邋ＣＤ邋１３３—邋ｈｅｐａｔｉｃ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｃｅ化邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｉｎ邋ＤＭＥＭ邋ｍｅ出ｕｍ邋ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ邋１０＊Ｘ＞邋ＦＢＳ逡逑４．２分離純化后Ｈ巧Ｇ２／ＣＤ１３３＋腫瘤干細胞在干細胞培養(yǎng)液中生長情況逡逑分離純化后Ｈ巧Ｇ２／ＣＤ１３３＋腫瘤干細胞經(jīng)過５天培養(yǎng)，在干細胞培養(yǎng)液中逡逑３２逡逑
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：2549771