【摘要】：背景與目的:近年來,盡管肺癌的檢查和治療手段取得了巨大進步,但其死亡率一直高居不下,肺癌仍然是人類目前死亡率最高的腫瘤之一,原因之一是治療后的復發(fā)、轉(zhuǎn)移及治療的耐藥性不能很好的解決。腫瘤干細胞(CSCs)是腫瘤細胞群體中一小部分具有自我更新及多向分化能力,并且具有高度的侵襲和轉(zhuǎn)移能力等特性的細胞。CSCs學說認為肺癌干細胞(LCSC)參與肺癌的癌變、發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤耐藥、以及腫瘤的復發(fā)等各個過程。另有研究發(fā)現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)同樣能夠增加腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,并且可以增加腫瘤細胞的干細胞特性,這也許是兩者關(guān)系密切的重要證據(jù)。尼古丁作為煙草中重要化學物質(zhì),能夠誘導包括肺癌在內(nèi)的多種人類癌細胞的EMT和促進侵襲轉(zhuǎn)移。尼古丁誘導侵襲和EMT的過程可能是肺癌發(fā)生耐藥和轉(zhuǎn)移的重要機制,可能對肺癌干細胞能夠產(chǎn)生同樣的作用。闡明EMT相關(guān)信號通路與LCSC相互作用機制,有望為吸煙肺癌患者的后續(xù)治療開辟新途徑。本研究目的主要是富集肺癌干細胞,檢測其干細胞特性,并探索尼古丁誘導的EMT對肺癌干細胞的作用,為后續(xù)進一步分子機制研究奠定基礎(chǔ)。材料與方法:(1)以人肺腺癌A549細胞株為研究對象;(2)應用劃痕實驗和Transwell侵襲實驗研究不同濃度尼古丁對肺癌細胞株遷移和侵襲能力的作用;(3)通過使用Real-time PCR和Western blot方法研究尼古丁對肺癌細胞EMT相關(guān)表面標志物m RNA和蛋白水平的影響;(4)通過免疫熒光技術(shù)檢測尼古丁誘導肺癌細胞EMT,發(fā)生β-catenin蛋白表達核轉(zhuǎn)移;(5)使用無血清懸浮培養(yǎng)法富集肺癌細胞球細胞;(6)應用流式細胞儀檢測側(cè)群細胞(SP)在細胞球細胞和親代肺癌細胞間的含量差異;(7)應用流式細胞儀檢測CD133在細胞球細胞和親代肺癌細胞中表達差異;(8)應用Real-time PCR技術(shù)檢測細胞球細胞和親代肺癌細胞株中ABCG2和CD133的m RNA表達水平差異,Western blot方法檢測細胞球細胞和親代肺癌細胞株中ABCG2蛋白表達差異;(9)流式細胞術(shù)檢測細胞球細胞和親代肺癌細胞株中的細胞周期差異;(10)應用CCK8法測定順鉑對肺癌細胞球細胞和親代肺癌細胞株的半數(shù)抑制濃度(IC50),繪制濃度-抑制率回歸曲線;(11)應用Transwell侵襲實驗比較細胞球細胞和親代肺癌細胞株體外侵襲能力差異;(12)應用Real-time PCR和Western blot方法研究尼古丁對細胞球細胞EMT相關(guān)表面標志物m RNA和蛋白水平的影響;(13)通過Transwell侵襲實驗研究尼古丁對細胞球細胞侵襲能力的影響;結(jié)果:(1)0.1、1、10μmol/L尼古丁處理肺癌細胞株24h、48h后進入劃痕區(qū)域細胞數(shù)量較0μmol/L組顯著增多,劃痕區(qū)域面積明顯縮小,經(jīng)方差分析尼古丁處理組遷移能力顯著高于未處理組(P=0.000)。(2)1μmol/L和0μmol/L尼古丁處理細胞后,Transwell侵襲實驗穿過基底膜的肺癌細胞數(shù)量為:106±2和67±2,尼古丁處理組細胞侵襲能力顯著增強(P=0.000)。(3)尼古丁處理肺癌細胞株48h后,E-cadherin表達下調(diào),Vimentin表達上調(diào)。0.1、1、10μmol/L尼古丁處理的肺癌細胞后,E-cadherin m RNA表達(0.81±0.03,0.49±0.01,0.39±0.05)低于未處理組細胞(1.00±0.12),與未處理組E-cadherin m RNA表達水平的2-ΔΔCT值比較有顯著性差異(P=0.000,0.000,0.000);0.1、1、10μmol/L尼古丁處理肺癌細胞后,Vimentin m RNA表達(1.64±0.07,2.03±0.06,2.35±0.10)明顯高于未處理組細胞(1.00±0.12),與未處理組Vimentin m RNA表達水平的2-ΔΔCT值比較有顯著性差異(P=0.000,0.000,0.000);0.1、1、10μmol/L尼古丁處理后,E-cadherin蛋白表達(0.27±0.002,0.25±0.005,0.18±0.003)低于未處理組細胞(0.30±0.003),與未處理組E-cadherin蛋白表達水平的灰度比值比較有顯著性差異(P=0.000,0.000,0.000);0.1、1、10μmol/L尼古丁處理后,Vimentin蛋白表達(0.52±0.008,0.86±0.005,1.14±0.010)高于未處理組細胞(0.37±0.005),與未處理組Vimentin蛋白表達水平的灰度比值比較有顯著性差異(P=0.022,0.000,0.000);1μmol/L尼古丁處理24,48,72h的肺癌細胞組E-cadherin蛋白表達(0.47±0.009,0.31±0.008,0.23±0.003)低于未處理組細胞(0.69±0.001),與未處理組E-cadherin蛋白表達水平的灰度比值比較有顯著性差異(P=0.000,0.000,0.000);1μmol/L尼古丁處理24,48,72h的肺癌細胞組Vimentin蛋白表達(0.09±0.003,0.32±0.003,0.40±0.003)高于未處理組細胞(0.06±0.002),與未處理組Vimentin蛋白表達水平的灰度比值比較有顯著性差異(P=0.002,0.000,0.000);(4)1μmol/L尼古丁處理肺癌細胞48h后,免疫熒光檢測顯示β-catenin蛋白發(fā)生核轉(zhuǎn)移。(5)無血清懸浮培養(yǎng)能夠形成細胞球細胞,且細胞球可穩(wěn)定傳代。(6)細胞球細胞SP陽性比例(12.36±1.47%)顯著高于親代肺癌細胞(5.79±0.11%),兩組間SP表達比較具有顯著性差異(P=0.000)。(7)細胞球細胞表面標志物CD133表達(15.90±0.32%)顯著高于親代肺癌細胞(0.40±0.02%),兩組間CD133表達比較具有顯著性差異(P=0.000)。(8)細胞球細胞CD133 m RNA表達(1.45±0.02)顯著高于親代細胞(1.00±0.07),兩組間CD133 m RNA表達水平的2-ΔΔCT值比較有顯著性差異(P=0.001)。(9)細胞球細胞ABCG2 m RNA表達(1.48±0.05)顯著高于親代細胞(1.00±0.05),兩組間ABCG2 m RNA表達水平的2-ΔΔCT值比較有顯著性差異(P=0.000);細胞球細胞ABCG2蛋白表達(0.75±0.001)顯著高于親代細胞(0.20±0.004),兩組間ABCG2蛋白表達水平的灰度比值比較有顯著性差異(P=0.000)。(10)細胞球細胞和親代肺癌細胞株的細胞周期分布經(jīng)F檢驗有顯著性差異(P=0.000)。細胞周期兩兩比較:細胞球細胞G0/G1期細胞含量(79.55±1.63%)顯著高于親代肺癌細胞(53.15±2.19%),兩組間比較具有顯著性差異(P=0.005);細胞球細胞G2/M期細胞含量(18.85±1.48%)與親代細胞(19.75±4.03%),兩組比較無明顯差異(P=0.795);細胞球細胞S期細胞含量(1.62±0.06%)顯著低于親代細胞(27.15±1.91%),兩組間比較具有顯著性差異(P=0.003)。(11)細胞球細胞對DDP的IC50值(7.07±0.85μg/L)顯著高于親代細胞(2.25±0.35μg/L),兩組細胞對DDP 48h的IC50值比較有顯著性差異(P=0.000)。(12)細胞球細胞和親代肺癌細胞株Transwell侵襲實驗穿過基底膜的細胞數(shù)量分別為:85±4和67±2,細胞球組穿過基底膜細胞數(shù)量明顯增多(P=0.001)。(13)肺癌細胞球細胞經(jīng)尼古丁處理后EMT相關(guān)標志物E-cadherin表達下調(diào),Vimentin表達上調(diào)。1μmol/L尼古丁處理48h的肺癌細胞組E-cadherin m RNA表達(0.60±0.02)低于未處理組細胞(1.00±0.12),兩組間E-cadherin m RNA表達水平的2-ΔΔCT值比較有顯著性差異(P=0.000);1μmol/L尼古丁處理處理48h的肺癌細胞組Vimentin m RNA表達(1.21±0.03)高于未處理組細胞(1.00±0.03),兩組間Vimentin m RNA表達水平的2-ΔΔCT值比較有顯著性差異(P=0.001);0.1、1、10μmol/L尼古丁處理后,E-cadherin蛋白表達(0.55±0.030,0.40±0.011,0.22±0.014)低于未處理組細胞(0.79±0.008),與未處理組E-cadherin蛋白表達水平的灰度比值比較有顯著性差異(P=0.000,0.000,0.000);0.1、1、10μmol/L尼古丁處理后,Vimentin蛋白表達(0.18±0.009,0.43±0.011,0.54±0.002)高于未處理組細胞(0.15±0.002),與未處理組Vimentin蛋白表達水平的灰度比值比較有顯著性差異(P=0.022,0.000,0.000);1μmol/L尼古丁處理24,48,72h的肺癌細胞組E-cadherin蛋白表達(0.39±0.005,0.34±0.004,0.26±0.005)低于未處理組細胞(0.53±0.008),與未處理組E-cadherin蛋白表達水平的灰度比值比較有顯著性差異(P=0.000,0.000,0.000);1μmol/L尼古丁處理24,48,72h的肺癌細胞組Vimentin蛋白表達(0.17±0.002,0.22±0.003,0.25±0.002)高于未處理組細胞(0.13±0.006),與未處理組Vimentin蛋白表達水平的灰度比值比較有顯著性差異(P=0.004,0.000,0.000);(14)1μmol/L和0μmol/L尼古丁處理細胞球細胞后,Transwell侵襲實驗穿過基底膜的細胞數(shù)量為:140±8和85±4,1μmol/L細胞球組數(shù)量顯著增多(P=0.000)。結(jié)論:(1)尼古丁處理肺癌細胞后從表面標志物表達水平和生物學行為上均表現(xiàn)出明顯EMT現(xiàn)象,侵襲能力呈現(xiàn)劑量和時間依賴性顯著增強;(2)通過無血清懸浮培養(yǎng)得到肺癌細胞球細胞具有顯著增強的自我更新、增殖、分化、耐藥及體外侵襲遷移能力,細胞球細胞多處于細胞周期靜止期,高表達ABCG2基因,并顯著高表達腫瘤干細胞標志物,細胞球細胞可作為肺癌干細胞進行后續(xù)實驗;(3)尼古丁可以誘導肺癌細胞球細胞即肺癌干細胞EMT,促進其侵襲轉(zhuǎn)移。
【圖文】：

理后A549細胞進入劃痕區(qū)域細胞數(shù)量較0μmol/L組顯著增多，，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。不同濃度尼古丁處理后能夠增強A549細胞遷移能力，并呈現(xiàn)濃度和時間依賴性提高細胞遷移能力(圖1.1，表1.7)。

圖1.2 Transwell侵襲實驗 A：對照組；B： 尼古丁處理組(×200)表1.8 尼古丁處理組和普通細胞侵襲能力比較尼古丁濃度（μmol/L） 穿過基底膜細胞數(shù)量（個） P0 67±20.0001 106±23 尼古丁對肺癌細胞 EMT 相關(guān) mRNA 表達的影響（1）細胞總 RNA 檢測測定所有細胞總RNA濃度及其OD 260/280比例均在1.8～2.0之間(最佳范圍.6-2.1)，細胞所提取RNA純度較高（表1.9）。A B
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：2549565