【摘要】：粘膜相關(guān)恒定T細(xì)胞已被證明在人體對抗感染性病原體的免疫防御過程中發(fā)揮重要作用,同時還能調(diào)控多種炎癥反應(yīng)性疾病的病理過程。然而,粘膜相關(guān)恒定T細(xì)胞在腫瘤免疫反應(yīng)中的作用尚不清楚。目的:借助免疫學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)等實驗技術(shù),通過體內(nèi)和體外實驗,1、明確CRC患者體內(nèi)MAIT細(xì)胞的表達(dá)及分布特點;2、分析MAIT細(xì)胞與CRC患者臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性;3、探索MAIT細(xì)胞的分泌功能及其對結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞生長的潛在影響。方法:1、通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測CRC患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)、腫瘤中心組織中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes,TIL)和腫瘤周圍組織中非腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(non-tumor infiltrating lymphocytes,NIL)內(nèi)MAIT細(xì)胞的表達(dá)并進(jìn)行相應(yīng)的表型分析,以健康對照者(healthy controls,HC)提取的PBMC、非腫瘤對照患者(the non-tumor controls,NT)正常粘膜組織提取的固有層單個核細(xì)胞(lamina propria mononuclear cells,LPMC)作為對照。通過免疫熒光技術(shù)檢測腫瘤中心組織和腫瘤周圍組織內(nèi)MAIT細(xì)胞的分布。2、引入CRC腫瘤TNM分期系統(tǒng)、血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)指標(biāo),利用分層分析的方法,研究MAIT細(xì)胞數(shù)量與CRC進(jìn)展的相關(guān)性。隨訪術(shù)后化療CRC患者,研究術(shù)后化療對MAIT細(xì)胞數(shù)量的影響。3、體外刺激條件下,通過流式多重蛋白定量(cytometric bead array,CBA)技術(shù)檢測MAIT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力。實時定量PCR(Quantitative real-time PCR)技術(shù)檢測腫瘤中心組織和腫瘤周圍組織內(nèi)TCRVα7.2-Jα33、TNF-α、IFN-γ和IL-17A m RNA的轉(zhuǎn)錄水平。借助Transwell共培養(yǎng)體系,模擬腫瘤微環(huán)境,研究HCT116細(xì)胞對MAIT細(xì)胞分泌功能的影響;通過碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色,研究HCT116細(xì)胞的細(xì)胞周期狀態(tài);通過Ed U核素滲入實驗,檢測HCT116細(xì)胞的增值情況。結(jié)果:1、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn),CRC患者外周血MAIT細(xì)胞比例較HC減少,以記憶性CD8+MAIT細(xì)胞亞型減少顯著;TIL內(nèi)MAIT細(xì)胞比例較LPMC、NIL增加,以CD8+MAIT細(xì)胞亞型增加顯著。免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn),MAIT細(xì)胞聚集于腫瘤中心組織內(nèi),而非腫瘤周圍組織。2、分層分析顯示,晚期CRC患者外周血MAIT細(xì)胞數(shù)量較早期CRC患者減少更為明顯;無論早期或晚期CRC患者,TIL內(nèi)MAIT細(xì)胞數(shù)量都高于自身NIL和外周血內(nèi)MAIT細(xì)胞數(shù)量,且TIL內(nèi)MAIT細(xì)胞數(shù)量與自身外周血內(nèi)MAIT細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)性。此外,CRC患者血清CEA水平與自身TIL內(nèi)MAIT細(xì)胞比例呈現(xiàn)明顯正相關(guān)性;有趣的是,晚期CRC患者血清CEA水平還與自身外周血MAIT細(xì)胞比例呈現(xiàn)出中等程度的負(fù)相關(guān)性。隨著CRC患者化療周期的進(jìn)行,外周血MAIT細(xì)胞比例也逐漸升高。3、MAIT細(xì)胞兼具Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞的分泌特點,而在CRC患者體內(nèi)更傾向于Th17細(xì)胞的功能。在Transwell共培養(yǎng)體系中,活化的MAIT細(xì)胞以數(shù)量依賴和接觸抑制的方式誘發(fā)了HCT116細(xì)胞的細(xì)胞周期G2期阻滯,這一顯現(xiàn)可以通過特異性的anti-MR1(MHC I-related molecule,MR1)抗體阻斷。結(jié)論:本研究結(jié)果表明,MAIT細(xì)胞具有從外周血向結(jié)直腸腫瘤組織內(nèi)浸潤的特性;MAIT細(xì)胞是潛在的評估CRC分期及預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志;MAIT細(xì)胞參與了CRC腫瘤免疫監(jiān)視的過程。
【圖文】：

如圖 2.1 對照組和 Transwell 共培養(yǎng)體系示意圖ig 2.1 Schematic diagram of control group and Transwell co-culture systeells were purified from five healthy controls and stimulated with, oomycin for 48 h. The unstimulated or activated MAIT cells were co-cuCT116 cells in a cell-cell contact or non-contact manner. The MAIcells in medium alone served as the controls. 染色檢測細(xì)胞周期116 細(xì)胞與活化的 MAIT 細(xì)胞在接觸或非接觸培養(yǎng)后的細(xì)胞周期狀檢測。向?qū)φ战M和 Transwell 共培養(yǎng)體系中分別加入或不加 10 μg/m究 anti-MR1 抗體能否對 Transwell 共培養(yǎng)體系內(nèi) HCT116 細(xì)胞的細(xì)為了檢測 HCT116 細(xì)胞在 Transwell 共培養(yǎng)體系中細(xì)胞周期狀態(tài)是否存在聯(lián)系，按 0:1、1:1、5:1、10:1 的比例，梯度設(shè)置活化的 MAIT 細(xì)胞與

PBMC were isolated from 22 healthy controls (HC) and 48 colorectal cancer (CRC) patientsand stained with fluorescent antibodies against CD3, CD161, TCRγ , and TCRV 7.2. Thefrequency of CD3+TCRγ V 7.2+CD161+ MAIT cells was characterized by flowcytometry. The cells were first gated on living lymphocytes and then on CD3+TCRγ T（ β T）cells. The percentages of CD3+TCRγ V 7.2+CD161+ MAIT cells in β T cellswere determined. Data are representative as one of the subjects.研究發(fā)現(xiàn)，CRC 患者外周血中 MAIT 細(xì)胞比例（0.98%）明顯低于健康對照者（2.45%），如圖 3.2A。相反，另一種天然 T 細(xì)胞——γ T 細(xì)胞，占 CD3+淋巴細(xì)胞的
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34

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本文編號：2548509