【摘要】：研究背景：乳腺癌已成為全球第一高發(fā)的女性惡性腫瘤和女性癌癥相關(guān)死亡的首要原因,過去30年中在我國的各大城市以及農(nóng)村地區(qū)也均呈現(xiàn)顯著增長,作為總?cè)丝谡紦?jù)世界五分之一的第一人口大國,我國有著極其龐大的乳腺癌患病人群。伴隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步,人們在乳腺癌的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化研究和臨床治療方面也取得了很大的進(jìn)展,目前乳腺癌治療即將步入“精準(zhǔn)醫(yī)療”時(shí)代。但是應(yīng)該看到的是,多年來乳腺癌的總體生存率并未得到顯著提高。乳腺癌發(fā)生遠(yuǎn)處侵襲、轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后較差、死亡率升高的重要因素。從分子生物學(xué)角度了解乳腺癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制以及發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移的原因、尋求乳腺癌惡性轉(zhuǎn)化的靶點(diǎn)及開發(fā)靶向性治療藥物是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。近年來,HMGB1 (high mobility group box chromosomal protein 1, HMGB1)對腫瘤生物學(xué)行為的影響及機(jī)制逐漸受到眾多研究者的關(guān)注。HMGB1是一種在真核生物細(xì)胞中普遍表達(dá)且進(jìn)化過程中高度保守的非組蛋白染色體核蛋白。多年來對HMGB1的研究揭示,其與惡性腫瘤的不斷增殖、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤新生血管生成、發(fā)生侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為緊密相關(guān),參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移全過程并發(fā)揮了重要作用,目前已成為腫瘤預(yù)防和診治研究熱點(diǎn),已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道其在多種惡性腫瘤中的表達(dá)情況并對其作用機(jī)制進(jìn)行了探討,但對于HMGB1與乳腺癌診治相關(guān)研究國內(nèi)外報(bào)道相對較少,抑制或上調(diào)HMGB1基因表達(dá)會(huì)對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為造成哪些影響,其在疾病發(fā)生和進(jìn)展過程中所起的具體作用和涉及到哪些信號通路仍不十分清楚。我們的研究旨在通過檢測HMGB1在乳腺癌組織及血清中的表達(dá)情況以及觀察抑制或上調(diào)HMGB1表達(dá)會(huì)對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株生物學(xué)行為造成哪些影響,并分析其影響機(jī)制,從而初步探討HMGB1在乳腺癌疾病發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用。目的：(1)分別采用免疫組織化學(xué)法(IHC)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測乳腺癌患者組織及血清中HMGB1表達(dá)情況,探討其表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系及其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。(2)觀察小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制或下調(diào)HMGB1基因表達(dá)后對人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞生物學(xué)行為的影響如何。(3)觀察重組HMGB1(rHMGB1)刺激人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231后對細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為的影響及相關(guān)基因、蛋白的變化情況并初步探討其可能的下游信號通路。方法：(1)采用IHC法分別檢測]MGBl在乳腺癌組織、癌旁正常乳腺對照組織以及乳腺良性疾病對照組中的表達(dá)水平；采用ELISA法分別檢測相對應(yīng)乳腺癌組、乳腺良性疾病對照組患者血清中HMGB1的表達(dá)水平,并統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組織及血清HMGB1表達(dá)水平相關(guān)性及其與臨床常用病理學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系。(2)設(shè)計(jì)并化學(xué)合成針對HMGB1的3對siRNA分子序列(siRNA H1、siRNA H2、siRNA H3),同時(shí)設(shè)空白對照組及陰性siRNA對照組。首先采用脂質(zhì)體法將siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞,然后通過RT-PCR和Western blot方法檢測HMGB1基因和蛋白表達(dá)水平的變化并記錄各siRNA的干擾效果；從中選擇出抑制作用最強(qiáng)的一組進(jìn)入后續(xù)細(xì)胞生物學(xué)行為影響研究,分別采用噻唑藍(lán)比色法(MTT)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)及Transwell法檢測轉(zhuǎn)染HMGBl-s iRNA后MDA-MB-231細(xì)胞在增殖、周期、凋亡以及侵襲力等方面生物學(xué)行為的變化。(3)20ng/ml重組HMGB1(rHMGBl)及其抗體刺激MDA-MB-231細(xì)胞24 h,采用MTT法檢測細(xì)胞增殖變化、Transwell法檢測細(xì)胞侵襲力變化；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及Western blot法檢測其對MDA-MB-231細(xì)胞核因子NF-κB/p65 (nuclear factor kappa B/p65, NF-κB/p65)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：(1)HMGB1在乳腺癌組織中表達(dá)水平明顯高于相對應(yīng)癌旁正常乳腺組織及乳腺良性疾病組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；組織中HMGB1的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞分化高低、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期等臨床常用參數(shù)密切相關(guān),其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；血清HMGB1含量在乳腺癌組亦明顯高于乳腺良性疾病組和正常志愿者對照組(P0.05),但乳腺癌患者血清HMGB1表達(dá)水平與臨床常用參數(shù)并無相關(guān),且腫瘤組織HMGB1高表達(dá)組與低表達(dá)組相比較,兩組血清HMGB1水平并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P0.05)。(2)3對特異性HMGBl-siRNAs轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后,HMGB1mRNA相對表達(dá)量分別為0.448±0.045、1.148±0.038、1.118±0.078,較空白對照組的1.393±0.070明顯減少(t值分別為25.393、6.878和5.867,P值均0.01)；3對特異性HMGB1-siRNAs轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后,HMGB1蛋白相對表達(dá)量分別為0.143±0.040、0.353±0.032、0.394±0.019,較空白對照組的0.600±0.064明顯減少(t值分別為13.540、7.718和6.900,P值均0.01),其中siRNA H1組抑制率約為70%,明顯高于其他組。與空白對照組相比,MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力在轉(zhuǎn)染siRNA H1后72h、96h、120h時(shí)受到顯著抑制,t值分別為7.130、30.972、25.679,P值均0.01,MTT檢測結(jié)果顯示：siRNA H1組細(xì)胞增殖率明顯低于空白對照組及陰性siRNA對照組(P0.01)；細(xì)胞周期分布結(jié)果顯示：siRNA H1組G0/G1期細(xì)胞所占比例明顯高于對照組(P0.01),而S期和G2/M期細(xì)胞所占比例則顯著下降(P0.01)；細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：siRNA H1組早期、中晚期細(xì)胞凋亡率及總凋亡率均顯著高于對照組(P 0.01); Transwell法結(jié)果顯示,siRNA-H1組細(xì)胞侵襲能力與空白對照組和陰性siRNA對照組相比有明顯下降(P0.01)。(3)MTT結(jié)果表明,MDA-MB-231細(xì)胞空白對照組與rHMGBl組、rHMGBl-抗體組、rHMGBl+IgG組、rHMGBl+rHMGB1-抗體組的吸光度分別為：0.266±0.038、0.712±0.039、0.283±0.030、0.709±0.022、0.201±0.027：重組HMGB1組MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力明顯強(qiáng)于空白對照組(P0.05)；20ng/mL重組HMGB1作用MDA-MB-231細(xì)胞24h后,NF-κB/p65及MMP-9mRNA相對表達(dá)量分別為1.244±0.115、1.440±0.081,較MDA-MB-231細(xì)胞空白對照組NF-κB/p65及MMP-9mRNA相對表達(dá)量為0.537±0.026、0.774±0.053顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；重組HMGB1作用MDA-MB-231細(xì)胞24h后,NF-κB/p65、MMP-9蛋白相對含量分別為0.497±0.069、0.383±0.017,較空白對照組NF-κB/p65、MMP-9蛋白的相對含量0.402±0.050、0.294±0.014均明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。rHMGBl作用MDA-MB-231細(xì)胞24 h后,Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,重組HMGB1組透膜細(xì)胞數(shù)為379±32個(gè),相對應(yīng)空白對照組透膜細(xì)胞數(shù)則僅為204±26個(gè),重組HMGB1組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲力明顯增強(qiáng),兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：(1)乳腺癌患者腫瘤組織以及血清中HMGB1均呈現(xiàn)高表達(dá)水平,且組織中表達(dá)水平與細(xì)胞分化程度高低、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期等臨床常用參數(shù)呈密切相關(guān),提示HMGB1作為輔助指標(biāo),在乳腺癌診斷、預(yù)后判斷以及乳腺癌診斷篩查中具有一定價(jià)值。(2)HMGB1-siRNA技術(shù)可有效抑制HMGB1表達(dá)并對MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲力等生物學(xué)行為造成影響,可進(jìn)一步探討將HMGB1作為治療靶點(diǎn)的可行性。(3)重組HMGB1組與空白對照組比較,可明顯增強(qiáng)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲能力,而HMGB1抗體可有效拮抗外源性HMGB1的作用。HMGB1可能是通過上調(diào)NF-κB/p65基因和蛋白的表達(dá)水平,進(jìn)而激活MMP-9等下游相關(guān)信號通路,其詳細(xì)作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。
【圖文】：

指標(biāo)邐乳腺癌邐分化程度邐淋己結(jié)轉(zhuǎn)移邐ＴＮＭ分期逡逑敏感性邐７３．２１％（４１／５６）邐８６．８４％（３３／３８）邐８８．００％（２２／巧）８９．４７％（１７／１９）逡逑特異性邐８４．００％（２１／巧）邐５５．５５％（１０／１８）邐３８．邋７１％（１２／３１）邐３５．邋１４％（１３／３７）逡逑陽性預(yù)測值邐９１．邋１１％（４１／４５）邐８０．４９％（３３＾Ｕ邐５３．６６％（２２／４１）邐４１．４６％（１７／４１）逡逑陰牲預(yù)測值邐５８．邋３３％（２１／３６）邐６６．６７％（１０／１５）撕．００％（１２／：１５）邐８６．６７％（口／１５）逡逑表１－４：各姐血清ＨＭＧＢ１含量逡逑分組邐ｎ邐ｓＨＭＧＢｌ邋含量（ｎｇ／ｍｌ）逡逑乳腺癌組邐５６邐４．６４邋＋邋２．５０＊逡逑乳腺良性疾病組邐２５邐１．３２邋＋邋０．６８逡逑正常志愿者沮邐３０邐１．邋：３６±０．７５逡逑＊／＜化０５邋ＶＳ良性疾病組及正常志愿者對照姐逡逑

１：空白對照姐；２：陰性ｓｉＲＮＡ對照組；３：邋ｓｉＫＮＡ邋ＨＩ組；４：邋ｓ巧ＮＡ邋Ｈ２}D；５：邋ｓ：ｉＲＮＡ組；ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細(xì)胞轉(zhuǎn)染ＨＭＧＢｌ邋ｓｉＲＮＡｓ邋７２ｈ后進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測ＨＭ她１蛋白水平，逡逑ＷＧＡＰＤＨ為內(nèi)參，計(jì)算蛋白條帶與ＧＡＰＤＨ蛋白條帶的相對強(qiáng)度，結(jié)果表明，，與陰性ＳｉＲＮ及空白對照組相比，R*�。卞澹螅椋遥危粒竺黠@下調(diào)R*ＧＢ１蛋白表達(dá)。＊：與空白對照組比較，〈０．邋０１邋（Ｘ邋＋邋■？邋，邋１１卻）逡逑表２－９：邋ｓｉＲＮＡ對ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細(xì)胞增殖的抑制作用（ｘ±＿ｙ，ｎ＝３）組別邐２４ｈ邐４加邐７２ｈ邐９化邐１２０ｈ逡逑空白對照邐０．３３８±０．０２４邐０．６０４邋±０．０６７邐０．６７１＋０．０２８邐１．３５４＋０．０４３邐１．１５５＋０．０５１逡逑陰性邋ＳｉＲＮＡ邐０．３７６邋＋邋０．０２２邐０．５９０邋＋邋０．０３４邐０．６８８＋０．０３２邐１．４４５＋０．０３６邐１．１３８＋０．０３６逡逑ＳｉＲＮＡ邋ＨＩ邐０．３５０邋＋邋０．０２７邐０．５１１＋０．０４８邐０．５０２＋０．０４５＊邐０．６５８邋±０．０２６＊邐０．５３０＋０．０１９＊逡逑＊；分別與空白對照姐及陰性ＳｉＲＮＡ巧比較，／＞＜０．０５逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

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1 俞燕;謝岷;賀鈺磊;許望瓊;朱珊;曹勵(lì)之;;高遷移率族蛋白1對阿霉素誘導(dǎo)的白血病K562細(xì)胞凋亡的影響[J];癌癥;2008年09期

本文編號：2548279