【摘要】：背景:眾所周知,腫瘤細胞的長期生存依賴于周邊的低氧酸性微環(huán)境,腫瘤酸性微環(huán)境對腫瘤的增殖、浸潤及轉移均發(fā)揮了重要作用。而正常細胞卻無法耐受這種胞外酸性胞內中性至堿性的特殊環(huán)境,推測腫瘤細胞之所以能在酸性環(huán)境下生存,一定有其自身的適應機制。自噬在清除有害物質、維持細胞穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用。酸性微環(huán)境能否誘導肺癌細胞自噬活化,以及自噬功能和具體作用機制,目前尚不清楚。目的:研究腫瘤賴以生存的酸性微環(huán)境對肺癌細胞自噬的影響及自噬所發(fā)揮的作用,探討酸誘導自噬的分子機制,從而為理解酸性微環(huán)境對肺癌細胞生存、增殖的影響,為腫瘤在酸性微環(huán)境下生存提供了理論支持,另外,通過對自噬活化的信號通路的研究有助于我們找到有效的抗腫瘤治療方法。方法:(1)明確酸性刺激誘導肺癌細胞自噬將A549和NCI-H226細胞株暴露于不同酸度的培養(yǎng)基,設定不同的培養(yǎng)時間,用western blot檢測自噬相關蛋白表達情況,進一步通過電鏡、熒光顯微鏡觀察酸性條件下肺癌細胞內自噬小體的變化情況;通過用western blot法檢測p62蛋白及細胞在自噬抑制劑Bafilomycin A1(Baf)作用下LC3 II的表達情況判斷自噬流的存在。(2)明確酸性刺激誘導肺癌細胞自噬的功能分別運用自噬抑制劑3-ma、baf及rna干擾方法抑制自噬后,用流式細胞儀檢測酸性環(huán)境下肺癌細胞凋亡水平的變化情況,westernblot法評估凋亡相關蛋白的表達。通過利用a549細胞建立裸鼠肺癌皮下瘤模型,用碳酸氫鈉干預腫瘤酸性微環(huán)境后,通過測量腫瘤的體積、重量,westernblot檢測自噬相關蛋白及凋亡相關蛋白的表達,判斷抑制自噬對肺癌細胞凋亡的影響。(3)明確酸性刺激誘導肺癌細胞自噬的作用機制不同酸濃度的培養(yǎng)基處理肺癌細胞后,westernblot檢測內質網應激相關重要信號分子及p-ampk、p-akt、p-mtor各分子的表達情況;用流式細胞儀檢測不同酸刺激后肺癌細胞內活性氧(ros)的變化情況;通過用ros抑制劑干預細胞后,westernblot檢測內質網應激相關信號分子的表達情況;通過用grp78sirna抑制內質網應激后,westernblot檢測酸性條件下肺癌細胞表達自噬相關蛋白及p-ampk、p-mtor的變化情況。用compoundc抑制ampk后,westernblot檢測lc3ii的表達水平。結果:(1)酸性微環(huán)境誘導肺癌細胞發(fā)生自噬,并在一定范圍內呈濃度-時間依賴性使用培養(yǎng)基(ph:6.6、6.9、7.4)分別培養(yǎng)a549和nci-h226細胞后,lc3ii和beclin1蛋白表達明顯上調,且以ph6.6培養(yǎng)基中細胞內lc3ii、beclin1蛋白表達量最高,相反,p62蛋白表達呈下降趨勢。透射電鏡觀察酸刺激下細胞內可見典型雙層膜的泡狀結構,即自噬小體形成。通過轉染gfp-lc3質粒,在熒光顯微鏡下觀察到肺癌細胞內點狀熒光較對照組明顯增多;暴露細胞于ph6.6培養(yǎng)基中分別作用12、24、48、72h后,lc3ii、beclin1蛋白表達呈時間依賴性。利用baf抑制自噬后,再給予細胞酸刺激,免疫熒光法發(fā)現點狀熒光聚集較對照組明顯增多,lc3ii蛋白表達也支持上述實驗結果。(2)酸誘導體內外肺癌細胞自噬具有保護作用分別用3-ma、baf抑制自噬后,再給予a549細胞酸處理,用流式細胞儀檢測細胞凋亡發(fā)現,酸聯(lián)合3-ma處理組細胞凋亡率為(35±3.25)%,酸聯(lián)合baf處理組細胞凋亡率為(37±4.26)%。下調自噬相關基因beclin1抑制自噬后,首先用cck-8法證實細胞活性較對照組明顯降低,進一步用流式細胞儀檢測發(fā)現細胞凋亡率在酸聯(lián)合beclin1sirna組明顯升高,cleavedcaspase3和cleavedparp表達也相應增強。裸鼠皮下瘤模型表明碳酸氫鈉組較對照組,腫瘤體積縮小,腫塊重量減輕,p62及cleavedcaspase3蛋白表達增強,細胞凋亡數明顯增多,提示酸誘導自噬使肺癌細胞免受凋亡。(3)明確酸性刺激下,自噬活化的分子機制不同酸性培養(yǎng)基作用于肺癌細胞后,p-perk、p-eif2a、grp78、xbp-1s、atf6和p-ampk蛋白表達均明顯增強,p-mtor表達減弱,p-akt表達無明顯變化,ros水平較對照組明顯升高,通過用抗氧化劑nac干預后,grp78、p-eif2a及l(fā)c3ii表達均減少,提示內質網應激的變化情況與ros呈正相關,進一步用grp78sirna抑制內質網應激后,p-AMPK表達減弱,p-mTOR表達增強,LC3 II含量降低,細胞免疫熒光法檢測發(fā)現點狀綠色熒光顆粒明顯減少。通過Compound C抑制AMPK以阻斷信號通路AMPK-mTOR后,LC3 II表達明顯減少。結論:(1)酸性刺激可誘導肺癌細胞自噬活化。(2)肺癌細胞自噬活化可以使其免受凋亡。(3)酸性條件下肺癌細胞內產生過多的ROS導致內質網應激,并順序激活AMPK-mTOR通路,誘導自噬產生,提示ROS-ERS信號通路參與自噬的活化。
【圖文】：

酸性培養(yǎng)基聯(lián) 不聯(lián) Baf 處理肺癌細胞 24h 后，，利用細胞免疫熒光技 檢測肺癌細胞內 噬小體 變化情況。本實驗設 control 組、Baf 組、酸處理組 酸+Baf 組。#p<0.05 與單純酸處理組比較。By pretreatment with Baf associated, lung cancer cells were cultured for 24h in acidic or normmedium, autophagysomes were detected by immunocytochemistry.圖 1-3-1. Baf 干預后，熒光顯微 下觀察胞內 噬小體情況

-1.細胞檢測肺癌細胞凋亡情況
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：2544612