【摘要】：膽管癌是除肝細(xì)胞癌最常見(jiàn)的肝膽系統(tǒng)惡性腫瘤，手術(shù)為其主要治療方式，但僅適用于少數(shù)患者。膽管癌對(duì)化療普遍不敏感。順鉑是目前臨床指南推薦的膽管癌化療藥物，但天然或獲得性耐藥嚴(yán)重影響其療效。研究膽管癌順鉑耐藥機(jī)制具有重要意義。目前認(rèn)為順鉑耐藥機(jī)制主要包括藥物濃度不足、DNA損傷修復(fù)異常和凋亡逃逸等。 線(xiàn)粒體是順鉑的細(xì)胞內(nèi)作用靶點(diǎn)之一，且線(xiàn)粒體凋亡途徑是順鉑發(fā)揮抗腫瘤作用的主要途徑之一。Bcl-2家族蛋白是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗凋亡家族成員與促凋亡家族成員的平衡影響線(xiàn)粒體外膜通透性形成，調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體凋亡途徑。在其他腫瘤中，Bcl-2家族蛋白已被證實(shí)與順鉑耐藥機(jī)制密切相關(guān)。然而目前關(guān)于膽管癌順鉑耐藥的機(jī)制研究較少。一些研究提示Bcl-2家族抗凋亡蛋白可能介導(dǎo)膽管癌耐受順鉑。 Bcl-2家族除調(diào)控線(xiàn)粒體外膜通透性外，也參與調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)。線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)主要指線(xiàn)粒體總量、線(xiàn)粒體間連接、線(xiàn)粒體亞細(xì)胞定位的動(dòng)態(tài)變化,主要涉及線(xiàn)粒體分裂融合和線(xiàn)粒體自噬兩個(gè)過(guò)程。目前認(rèn)為線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞凋亡有關(guān)。線(xiàn)粒體通過(guò)分裂和融合產(chǎn)生短線(xiàn)粒體和長(zhǎng)線(xiàn)粒體。線(xiàn)粒體分裂通常有利于哺乳動(dòng)物中線(xiàn)粒體外膜通透性形成，而線(xiàn)粒體融合則會(huì)降低細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性。一些學(xué)者懷疑線(xiàn)粒體融合是順鉑耐藥的潛在機(jī)制。目前公認(rèn)線(xiàn)粒體分裂是線(xiàn)粒體自噬發(fā)生的前提。線(xiàn)粒體自噬是一種特殊形式的自噬。它在化療耐藥中的作用尚不明確。過(guò)度線(xiàn)粒體自噬可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡。線(xiàn)粒體融合可抑制線(xiàn)粒體自噬發(fā)生，從而可能干擾線(xiàn)粒體自噬性細(xì)胞死亡。因此線(xiàn)粒體自噬也可能參與膽管癌順鉑耐藥。 本研究以人膽管癌細(xì)胞細(xì)胞株RBE為研究對(duì)象，以Bcl-2/Bcl-W/Bcl-xL抑制劑ABT737為工具，探討B(tài)cl-2家族及線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)在人膽管癌細(xì)胞順鉑耐藥中的作用及機(jī)制，為膽管癌治療提供新的治療策略和方向。 方法 （1）細(xì)胞生存率由MTT法檢測(cè)，Hoechst33342染色檢測(cè)細(xì)胞核凋亡形態(tài)變化，細(xì)胞凋亡由Annexin V/PI染色后流式細(xì)胞術(shù)定量。DCFH-DA染色標(biāo)識(shí)ROS變化，JC-1染色顯示線(xiàn)粒體膜電勢(shì)變化并由流式細(xì)胞術(shù)定量。 （2）Western blot檢測(cè)細(xì)胞總蛋白Bcl-2、Bak、Mcl-1蛋白水平。線(xiàn)粒體分離試劑盒獲取線(xiàn)粒體和胞漿成分,并提取蛋白。Western blot檢測(cè)胞漿蛋白細(xì)胞色素C、Bcl-2蛋白水平。 （3）MitoTracker Red特異性標(biāo)志線(xiàn)粒體，激光共聚焦觀測(cè)線(xiàn)粒體形態(tài)，同時(shí)Hoechst33342標(biāo)記細(xì)胞核。Western blot檢測(cè)細(xì)胞總蛋白中分裂融合相關(guān)蛋白Mfn2、OPA1、Drp1、Fis1蛋白水平，線(xiàn)粒體蛋白及胞漿蛋白中Drp1蛋白水平。間接免疫熒光染色，激光共聚焦觀察線(xiàn)粒體與Drp1共定位。 （4）Western blot檢測(cè)細(xì)胞總蛋白中p62和LC3蛋白水平。間接免疫熒光染色，激光共聚焦觀察線(xiàn)粒體(MitoTracker Red)與p62、與LC3共定位。激光共聚焦觀察LysoTracker Red（特異標(biāo)記酸性細(xì)胞器）與MitoTracker Green（標(biāo)記線(xiàn)粒體）共定位。 （5）免疫熒光染色后激光共聚焦觀察不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)p62表達(dá)及線(xiàn)粒體與p62共定位情況。 （6）依據(jù)p62基因序列（GenBank：NM_003900），構(gòu)建pGCsilencerTMU6/Neo/GFP/RNAi重組質(zhì)粒，命名為Si-p62，通過(guò)Western blot、熒光觀察等技術(shù)驗(yàn)證。 （7）檢測(cè)RNAi p62后，細(xì)胞生存率由MTT法檢測(cè)。Western blot檢測(cè)細(xì)胞總蛋白中p62、Tom20、Drp1的表達(dá)水平。 結(jié)果 （1）ABT737合加順鉑能夠有效地誘導(dǎo)人膽管癌細(xì)胞凋亡，而相同濃度順鉑只能致極少數(shù)細(xì)胞發(fā)生凋亡。聯(lián)合用藥能增加ROS蓄積、誘導(dǎo)線(xiàn)粒體膜電勢(shì)的下降，，并誘導(dǎo)更多細(xì)胞色素C由線(xiàn)粒體向細(xì)胞漿釋放。 （2）與單加順鉑組相比， ABT737聯(lián)合順鉑可明顯增高M(jìn)cl-1(32kD)/Mcl-1(40kD)比例、Bak表達(dá)量并影響B(tài)cl-2的線(xiàn)粒體定位。 （3）順鉑能夠誘導(dǎo)人膽管癌細(xì)胞線(xiàn)粒體融合。合加ABT737能夠下調(diào)Mfn2、OPA1(120kD)表達(dá)，上調(diào)線(xiàn)粒體分裂蛋白Fis1水平，增加Drp1(60kD)/(80kD)比例，并可促進(jìn)Drp1(60kD)向線(xiàn)粒體移位，線(xiàn)粒體主要以分裂形式存在，且線(xiàn)粒體分裂發(fā)生于凋亡之前。抑制線(xiàn)粒體分裂可部分減輕聯(lián)合用藥的殺傷作用。 （4）單加順鉑和ABT737均能夠輕度誘導(dǎo)人膽管癌細(xì)胞自噬活化，而聯(lián)合用藥能夠明顯強(qiáng)化自噬的活化。ABT737聯(lián)合順鉑可以促進(jìn)線(xiàn)粒體和p62、LC3、酸性細(xì)胞器的相互作用及并降低Tom20蛋白水平。RNAi p62后升高Tom20，同時(shí)提高人膽管癌細(xì)胞生存率。 （5）ABT737聯(lián)合順鉑作用時(shí)，p62聚集體在線(xiàn)粒體分裂為主細(xì)胞中明顯多于以線(xiàn)粒體融合為主的細(xì)胞，同時(shí)RNAip62后，影響Drp1表達(dá)，特別是影響Drp1(60kD)/Drp1(80kD)比例。 結(jié)論 本研究以人膽管癌細(xì)胞株RBE作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)RBE細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性差，而合加ABT737后可明顯增加順鉑的殺傷作用。合加后發(fā)現(xiàn)ROS蓄積、線(xiàn)粒體膜電勢(shì)下降，更多細(xì)胞色素C釋放，提示順鉑對(duì)膽管癌殺傷作用差可能與線(xiàn)粒體損傷不足有關(guān)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：合加組影響B(tài)cl-2家族蛋白表達(dá)量及亞細(xì)胞定位，提示Bcl-2家族蛋白可能影響膽管癌對(duì)順鉑反應(yīng)性。 順鉑可明顯誘導(dǎo)RBE細(xì)胞線(xiàn)粒體融合，而合加ABT737后可逆轉(zhuǎn)為線(xiàn)粒體分裂，線(xiàn)粒體分裂早于凋亡發(fā)生，且抑制分裂能夠提高細(xì)胞生存率，提示線(xiàn)粒體融合是膽管癌耐受順鉑的機(jī)制之一，同時(shí)干預(yù)融合可以逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥；合加ABT737后自噬明顯活化，且順鉑單加組線(xiàn)粒體自噬不明顯，合加組線(xiàn)粒體自噬明顯增多。抑制線(xiàn)粒體自噬后，細(xì)胞生存率提升。提示ABT737合加順鉑可能通過(guò)誘導(dǎo)過(guò)度線(xiàn)粒體自噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡�；谝陨辖Y(jié)果，我們推測(cè)膽管癌的順鉑耐藥與其線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)密切相關(guān)。 ABT737聯(lián)合順鉑作用，p62聚集體在線(xiàn)粒體分裂為主的細(xì)胞中明顯多于以線(xiàn)粒體融合為主的細(xì)胞，降低p62后，影響Drp1表達(dá)并影響線(xiàn)粒體自噬。提示p62可能通過(guò)影響線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)干預(yù)聯(lián)合用藥對(duì)人膽管癌細(xì)胞的殺傷作用。 綜上，我們以人膽管癌細(xì)胞系RBE作為研究對(duì)象，以Bcl-2/Bcl-xL/Bcl-W抑制劑ABT737作為研究工具，證明膽管癌可能通過(guò)影響B(tài)cl-2家族蛋白表達(dá)水平及定位、降低線(xiàn)粒體損傷、影響線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)來(lái)抵抗順鉑殺傷作用。ABT737能夠干擾上述過(guò)程，增加膽管癌對(duì)順鉑的敏感性�？赡転榕R床治療膽管癌提供新的化療方案。
【圖文】：

圖 1.1 線(xiàn)粒體凋亡途徑及外源性凋亡途徑體動(dòng)力學(xué)與凋亡粒體分裂融合與凋亡線(xiàn)粒體分裂融合線(xiàn)粒體多被描述為扁豆樣的細(xì)胞器均勻散落在細(xì)胞漿之中，體通常是呈條索狀、相互交織甚至呈網(wǎng)狀（networks）。線(xiàn)斷變化之中，即通過(guò)調(diào)整線(xiàn)粒體分離和融合過(guò)程以產(chǎn)生較短]。研究者誘導(dǎo)由不同標(biāo)簽標(biāo)記的線(xiàn)粒體膜發(fā)生融合，融合發(fā)可完成內(nèi)部成分的充分混合[64]。進(jìn)一步研究證明，在能量離子水平波動(dòng)和有絲分裂等應(yīng)激條件下，線(xiàn)粒體可以在短時(shí)

1.3 線(xiàn)粒體分裂與線(xiàn)粒體嵴重構(gòu)共同參與調(diào)控細(xì)胞色素 C 的釋放左側(cè)：在某些依賴(lài)于 Bax/Bak 的刺激下，Bax 轉(zhuǎn)位于線(xiàn)粒體外膜，并在之后的線(xiàn)位點(diǎn)出寡聚化，最終導(dǎo)致線(xiàn)粒體內(nèi)外膜間隙中的少量細(xì)胞色素 C 等釋放入細(xì)rp1 亦可能參與這一過(guò)程）。MOMP 發(fā)生的同時(shí)，Drp1 可與釋放出的因子 DDP/TIM作用，并重新募集至線(xiàn)粒體，誘導(dǎo)線(xiàn)粒體分裂，并導(dǎo)致 OPA1 的失能。最終導(dǎo)致的完全開(kāi)放，釋放出嵴內(nèi)部之細(xì)胞色素 C；右側(cè)：黑色箭頭，當(dāng)細(xì)胞色素 C 完全胞迅速死亡；紅色箭頭：當(dāng)線(xiàn)粒體分裂被抑制后，線(xiàn)粒體嵴內(nèi)的細(xì)胞色素 C 不釋ase 激活受限，細(xì)胞存活時(shí)間延長(zhǎng)。需要注意的是：盡管Drp1是目前公認(rèn)調(diào)控線(xiàn)粒體分裂融合最主要的蛋白分裂仍是一種受多種蛋白調(diào)控的過(guò)程。Ishihara等在Drp1敲除小鼠的M，用放線(xiàn)菌素D仍可刺激線(xiàn)粒體分裂[81]。因此，需要觀察其他線(xiàn)粒體分白的異常表達(dá)是否影響線(xiàn)粒體分裂和凋亡，以佐證二者之間的關(guān)系[84
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2536034