【摘要】：背景過繼免疫治療(adoptive immunotherapy, AIT)是腫瘤免疫治療的重要方法之一,顯現(xiàn)出了一定的抗腫瘤作用。近年來(lái),嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)修飾T淋巴細(xì)胞的靶向免疫治療新策略,賦予T淋巴細(xì)胞持久的生命力,更強(qiáng)的增殖性,靶向殺傷活性,進(jìn)一步提高了AIT的療效。表皮生長(zhǎng)因子受體III型突變體(epidermal growth factor receper variantⅢ EGFRvⅢ)在腦膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中表達(dá)率較高,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),是腫瘤靶向治療的理想分子靶點(diǎn)。本研究設(shè)計(jì)第三代嵌合抗原受體EGFRvⅢscFv-CD28-CD137-CD3ζ,構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體,為嵌合抗原受體修飾T淋巴細(xì)胞的腫瘤免疫治療提供實(shí)驗(yàn)條件。目的構(gòu)建嵌合抗原受體EGFRvⅢscFv-CD28-CD137-CD3 C慢病毒表達(dá)載體,包裝嵌合抗原受體基因表達(dá)的慢病毒,體外感染293T細(xì)胞,使之高效表達(dá)該基因,為提高過繼免疫治療的抗腫瘤活性提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法靶向EGFRvⅢ的第三代嵌合抗原受體由EGFRvⅢscFv (726bp)、鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)(213bp), CD28 (123bp)、CD137胞內(nèi)信號(hào)區(qū)(126bp), CD3ζ鏈(336bp)組成,通過Oligo化學(xué)合成、PCR擴(kuò)增方法,成功合成嵌合抗原受體EGFRvⅢscFv-CD28-CD137-CD3 ζ的基因,將目的基因克隆入載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 的 EcoR1和BamH1位點(diǎn),進(jìn)行雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證后,與慢病毒包裝質(zhì)粒pVSVG;和pDe18.9共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝成慢病毒,測(cè)定病毒滴度,慢病毒感染293T細(xì)胞,Western blot檢測(cè)目的基因表達(dá)。結(jié)果EGFRvⅢscFv和基因合成的CD28-CD137-CD3 ζ片段,通過重疊PCR拼接成EGFRvⅢscFv-CD28-CD137-CD3 ζ (EGFRvⅢ/CAR),目的基因EGFRvⅢ/CAR和表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP通過EcoR1和BamH1雙酶切后連接,經(jīng)過雙酶切和測(cè)序證實(shí)目的基因EGFRvⅢ/CAR克隆入慢病毒表達(dá)載體內(nèi)并且序列正確,成功包裝了慢病毒,病毒滴度為1.5×108TU/ml,感染293T細(xì)胞、提取細(xì)胞中的蛋白質(zhì),CD3ζ抗體免疫印跡證實(shí)EGFRvⅢ/CAR的表達(dá)(分子量約58KDa)。結(jié)論成功構(gòu)建嵌合抗原受體EGFRvⅢ/CAR慢病毒表達(dá)載體,成功制備慢病毒,慢病毒感染293T細(xì)胞后,目的基因能高效的表達(dá),為慢病毒介導(dǎo)的嵌合抗原受體修飾T淋巴細(xì)胞靶向治療腫瘤的研究奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.51

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本文編號(hào)：2530643